Визуализация УФ-индуцированной репликации промежуточных Е. палочки Использование двумерных агарозном гель-анализа

Общая цель данной процедуры — визуализация структурных интермедиатов ДНК, возникающих при столкновении репликации с повреждениями ДНК, с помощью двухмерного гель-анализа. Для этого сначала выделяют ДНК из активно делящихся клеток, в которых были индуцированы блокирующие репликацию повреждения. Затем используют гель-электрофорез для разделения выделенной ДНК по размеру.

Затем дорожки вырезают и переливают горизонтально во второй гель, который обеспечивает дополнительное разделение ДНК как по размеру, так и по форме. В завершение проводится Саузерн-блот-анализ для визуализации структур ДНК, связанных с реплицирующимися фрагментами ДНК до и в различные моменты времени после нанесения повреждений, индуцированных УФ-излучением. В конечном счете эта процедура позволяет показать, что неспособность определенных мутантов устранять повреждения ДНК приводит к накоплению интермедиатов репарации ДНК.

Здравствуйте, меня зовут Артур Иан. Я из лаборатории Corella в Университете штата Портленд. Здравствуйте, меня зовут Бранд Ше, я также из лаборатории Corella.

Сегодня мы продемонстрируем процедуру двумерного гель-электрофореза. В нашей лаборатории мы используем этот метод для изучения интермедиатов репликации и репарации ДНК. Итак, приступим.

Для начала данной процедуры вырастите ночную культуру e coli объемом 200 µL, содержащую плазмиду PBR 3 22, в среде DGC thigh с ампициллином при 37 °C. Использование среды DGC thigh минимизирует экранирование УФ-излучения. После ночной инкубации осадите клетки центрифугированием при 14 000 rpm в течение 30 секунд.

Затем ресуспендируйте осадок клеток в 200 µL среды DG C без ампициллина и проведите инокуляцию. Культивируйте клетки в 20 мл среды DG C без селекции ампициллином в шейкере-инкубаторе при 37 °C до достижения OD 600 0,5, что соответствует примерно 5 × 10⁸ клеткам/мл. Рост без ампициллина позволяет избежать негативного отбора в отношении аномальных или непродуктивных интермедиатов репликации, которые могут возникать у некоторых мутантов.

Кроме того, при использовании УФ-излучения для индукции повреждений необходимо удалить ампициллин из среды, поскольку он сильно поглощает излучение на этих длинах волн и экранирует клетки, снижая эффективную дозу УФ во время их роста. Используйте UVC-фотометр, чтобы определить расстояние от бактерицидной лампы мощностью 15 ватт, которая обеспечивает интенсивность облучения примерно один JUUL на квадратный метр в секунду.

Последующие этапы следует проводить при желтом свете, чтобы предотвратить обратную фотореактивацию циклобутановых пиримидиновых димеров фотолиазой после УФ-облучения. По достижении требуемой плотности клеток с помощью пипетки перенесите культуру в чашку Петри диаметром 15 см, установленную на вращающейся платформе для обеспечения равномерного облучения всей популяции клеток. Затем облучите культуры дозой 50 joules per meter squared, немедленно перенесите их в стерильный предварительно нагретый флакон и поместите обратно в шейкер-инкубатор при 37 °C.

На протяжении всего эксперимента эта доза вызывает образование в среднем одного циклобутан-пиримидинового димера на каждые 4,5 килобаз одноцепочечной ДНК для каждой исследуемой временной точки. Перенесите пипеткой аликвоту культуры объемом 0,75 миллилитра в 0,75 миллилитра ледяного буфера net 30. Буфер net 30 служит стоп-буфером, который предотвращает протекание репликации и эксцизионной репарации нуклеотидов.

После добавления стоп-буфера образцы можно хранить на льду до завершения временного курса. По окончании временного курса осадите каждую пробу центрифугированием и ресуспендируйте осадки. Лизируйте клетки в 150 µl лизирующего буфера при 37 °C в течение 20 минут без перемешивания.

Поскольку структуры репликации с одноцепочечными участками или точками ветвления более подвержены сдвиговому воздействию, срезайте кончики наконечников пипеток лезвием бритвы, чтобы расширить отверстие и минимизировать силы сдвига. В целом, следует свести к минимуму количество этапов пипетирования и перемешивания до тех пор, пока ДНК не будет расщеплена рестриктазами. После лизиса добавьте протеиназу K и саркозил, и продолжайте инкубацию в течение одного часа. Это необходимо для высвобождения фрагментов ДНК, связанных с белками.

Поскольку активно реплицирующаяся ДНК часто связана с белковыми или мембранными комплексами, это способствует увеличению выхода фрагментов репликации. Через один час экстрагируйте образцы, добавив в каждый из них два объема фенола и осторожно перемешивая пробирки путем переворачивания в течение пяти минут. Затем добавьте два объема смеси хлороформа и изоамилового спирта и снова осторожно перемешивайте пробирки путем переворачивания в течение еще пяти минут.

Затем центрифугируйте образцы в микроцентрифуге при 14, 000 RPM в течение пяти минут и перенесите верхнюю водную фазу каждого образца в новую пробирку. Затем добавьте четыре объема смеси хлороформа и изопропилового спирта и снова осторожно перемешивайте пробирки путем инверсии в течение пяти минут. Повторно центрифугируйте образцы при 14, 000 RPM в течение пяти минут.

Поместите диализную мембрану на 250 milliliters 0,1 xte в стакане и нанесите по 100 microliters каждого образца на мембрану. Оставьте образцы для диализа на один час. Перенесите по 80 microliters каждого образца в новую пробирку объемом 1,5 milliliter, содержащую 20 microliters смеси ферментов.

Инкубируйте образцы для переваривания в течение ночи при 37 °C. PV two линеаризует плазмиду непосредственно ниже точки начала репликации. Перед нанесением на агарозный гель добавьте 100 µL хлороформа и 20 µL 6x красителя для нанесения, содержащего бромфеноловый синий.

Добавьте феноловый синий и ксиленовый цианин в каждый образец и перемешайте; хлороформ удалит любой оставшийся белок PV2, связанный с концами ДНК. Начните двумерный электрофорез в агарозном геле, проведя разделение рестрикционных образцов ДНК в первом измерении. Сначала нанесите маркер размеров Lambda Hind III в первую лунку предварительно приготовленного 0,4% агарозного геля в 1X TBE.

Затем внесите по 40 µL водной фазы, содержащей краситель для нанесения, для каждого образца, оставляя пустые лунки для облегчения последующего разрезания геля. После электрофореза проводите разделение в первом измерении при напряженности поля 1 В/см в течение примерно 12–15 часов. Низкое напряжение и низкая концентрация AGROS-геля позволяют разделять фрагменты ДНК преимущественно по размеру.

После завершения разделения в первом измерении с помощью большого мясницкого ножа вырежьте первую дорожку, содержащую маркер Lambda Hind III, и окрасьте ее бромидом этидия. Для второго измерения вырежьте дорожки геля большим мясницким ножом, используя маркер Lambda Hind III в качестве ориентира; отрежьте и удалите область ниже того места, где в каждой дорожке ожидается миграция линеаризованной плазмиды. Чтобы сформировать второе измерение, расположите каждый вырезанный фрагмент горизонтально по верхнему краю пустой формы для отливки геля.

Приготовьте 1% раствор AROS в XTBE и охладите его до 55 °C. После охлаждения залейте гелевый раствор для формирования второго измерения, убедившись, что срезы геля полностью покрыты. Перед заливкой геля важно убедиться, что срезы ориентированы равномерно, а форма для отливки находится в горизонтальном положении.

После застывания геля проведите электрофорез во втором измерении в течение от пяти с половиной до семи часов при напряжении 6,5 В/см в электрофорезе unit, обеспечивающем рециркуляцию буфера; высокое напряжение и высокий процент Agarose-геля позволяют эффективно разделять фрагменты ДНК как по их размеру, так и по форме. Фрагменты с нелинейной структурой перемещаются во втором измерении медленнее после проведения электрофореза. Однократно промойте гель в воде, затем дважды промойте его в 400 мл 0,25 М соляной кислоты в течение 15 минут при осторожном перемешивании.

Кислотные промывки служат для частичного расщепления молекул ДНК на более мелкие фрагменты, которые более эффективно переносятся при саузерн-анализе; это необходимо из-за большого размера и необычной формы интермедиатов репликации ДНК. Чтобы подготовить гель к щелочному переносу, снова промойте гель в воде, затем дважды промойте его в 400 миллилитрах 0,4 молярного гидроксида натрия в течение 30 минут. Затем ДНК из гелей переносится на нейлоновую мембрану High Bond N+ с помощью системы нисходящего щелочного переноса с использованием 0,4 молярного гидроксида натрия, как описано в текстовой части данной процедуры; перенос ДНК должен длиться от 6 до 12 часов. После переноса ДНК приступайте к гибридизации с зондом, как изложено в письменном протоколе.

После проведения зондирования и промывки мембраны положите её на бумажное полотенце до полного впитывания жидкости. Затем оберните мембрану поливинилхлоридной пищевой пленкой и поместите её на экран фосфоимиджера. На заключительном этапе визуализацию и количественный анализ радиоактивности проводят с помощью системы storm eight 40 и соответствующего программного обеспечения image quant.

На схеме представлена картина миграции двух переваренных плазмид PBR 3 22, наблюдаемая при анализе в 2D-агарозном геле. Нереплицирующиеся линейные плазмиды мигрируют как линейные фрагменты размером 4.4 KB; реплицирующиеся формы плазмид образуют Y-образные структуры, которые мигрируют медленнее, чем нереплицирующиеся фрагменты, из-за большего размера и нелинейной формы. Эта картина миграции после УФ-облучения представляет собой дугу, которая extending от линейной области в сторону лунки.

В конусообразной области наблюдаются молекулы в форме двойной Y или X, которые мигрируют медленнее, чем дуга Y-образных молекул. Приведен пример анализа нижней части 2D-геля, гибридизированного с PBR 3 22, меченным P 32, для клеток сразу после УФ-облучения и через 15 минут после УФ-облучения. Примерно 1% всей плазмидной ДНК обнаруживается в Y-дуге, когда клетки быстро растут в экспоненциальной фазе после облучения.

При накоплении заблокированных репликационных вилок в местах повреждений наблюдается временное увеличение количества молекул Y-образной формы. L-образные репликационные интермедиаты также временно накапливаются и сохраняются до момента, который коррелирует со временем восстановления повреждений. Мы только что продемонстрировали вам способ визуализации интермедиатов репарации ДНК с помощью двумерного гель-электрофореза.

При выполнении данной процедуры важно учитывать воздействие сил сдвига, которые могут снизить выход продукта, и бережно обращаться со всеми образцами и гелями. На этом всё. Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.