Опробование β-амилоида Токсичность использованием трансгенных С. Элеганс Модель

Общая цель следующего эксперимента заключается в анализе токсичности бета-амилоидного пептида в модельной системе InVivo. Воспроизводимость и относительная простота этого анализа позволяют быстро тестировать влияние лекарственных препаратов, условий окружающей среды или генетических модификаций на токсичность бета-амилоида. Ключевым фактором в разработке данного анализа является создание трансгенных червей C. elegans с мышечно-специфичной температурно-индуцибельной экспрессией бета-амилоидного пептида.

Эта температурно-зависимая экспрессия создается путем конструирования трансгена, содержащего аномально длинную 3'-нетранслируемую область, что делает мРНК трансгена мишенью системы контроля качества мРНК. Следовательно, экспрессия этого трансгена у червей дикого типа с функциональной системой контроля качества мРНК остается низкой из-за деградации мРНК трансгена. Если данный трансген вводится в генетический фон с мутацией в основном компоненте системы контроля качества мРНК, экспрессия трансгена будет значительно выше. Если генетический фон содержит температурно-чувствительную мутацию в системе контроля качества мРНК, то разведение этого трансгенного штамма при непермиссивной температуре заблокирует деградацию мРНК трансгена и приведет к его высокой экспрессии. В трансгенных червях, использующих эту систему для регуляции экспрессии бета-амилоидного пептида в мышцах стенки тела, повышение температуры с 16 °C до 25 °C приводит к высокому накоплению бета-амилоидного пептида, дисфункции мышечных клеток и параличу червей; при этом измеряется время наступления данных эффектов.

Время, необходимое для паралича популяции этих трансгенных червей после повышения температуры, представляет собой чувствительный метод анализа токсичности бета-амилоида. Это достигается путем приготовления свежих чашек с питательной средой для нематод специально для анализа паралича, что позволяет минимизировать влияние факторов окружающей среды на скорость развития паралича.

На втором этапе создают возрастно-синхронизированные популяции трансгенных червей; это позволяет минимизировать влияние стадии развития на экспрессию трансгена. Затем синхронизированных особей на третьей личиночной стадии переносят из условий с температурой 16 °C в условия с температурой 25 °C, что повышает стабильность мРНК трансгена и приводит к накоплению бета-амилоидного пептида. Измерение времени от повышения температуры до наступления паралича для каждого червя позволяет определить скорость развития мышечной дисфункции, тем самым оценивая токсический эффект накопления бета-амилоидного пептида. Полученные результаты демонстрируют влияние конкретных методов терапии на токсичность эндогенно экспрессируемого бета-амилоидного пептида.

Таким образом, основным преимуществом нашего метода по сравнению с использованием трансгенных моделей мышей для анализа активности препаратов является то, что наш подход позволяет проводить исследования гораздо быстрее и с меньшими затратами. Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение, так как освоение оценки состояния червей на стадии L4 в тесте на паралич представляет собой довольно сложную задачу.

Таким образом, при оценке парализованной нематоды на стадии L4 необходимо обратить внимание на изолированные движения головы. Если голова движется, в то время как всё тело червя парализовано, такая особь считается парализованной. Тесты на паралич проводятся на чашках со стандартной средой для выращивания нематод (NGM), которая обычно используется для разведения и генетических исследований C. elegans.

Для подготовки чашек автоклавируйте раствор NGM, содержащий хлорид натрия, агар и пептид, в колбе Эрленмейера, затем добавьте соответствующие количества следующих стерильных растворов, указанных в прилагаемом письменном протоколе. Расподелите по 10 миллилитров жидкого NGM в каждую чашку Петри размером 60 на 15 миллиметров. Оставьте NGM для затвердевания на ночь при комнатной температуре.

При проверке воздействия соединений или экстрактов распределите экстракт по каждой чашке и с помощью шпателя равномерно разнесите его по поверхности чашки. Оставьте чашки подсыхать на ночь при комнатной температуре. Объемы более 1 мл потребуют большего времени для высыхания.

Затем на каждую чашку нанесут по 250 мкл штамма E. coli OP 50, выращенного в среде LB в течение ночи до достижения оптической плотности от 0,4 до 0,6; бактериям дают высохнуть в течение ночи при комнатной температуре. Возраст чашки оказывает существенное влияние на частоту паралича, при этом более старые чашки имеют тенденцию к пересыханию. Чашки следует готовить не ранее чем за одну неделю до проведения анализа на паралич.

В идеале следует использовать чашки, которые были залиты за три-четыре дня до синхронной откладки яиц; все чашки, используемые в любом эксперименте, должны быть из одной партии. Изменение размера газона или типа бактерий также изменит поведение червей. Анализы на паралич могут быть проведены с использованием альтернативных штаммов e coli. Например, HT115 используется в экспериментах по РНК-интерференции. Однако это может изменить кинетику анализа на паралич.

Таким образом, необходимо использовать соответствующие внутренние контроли штаммов. Для анализа паралича, индуцированного бета, чаще всего используется штамм CL 476. Этот штамм и другие трансгенные модели доступны для академических исследователей за номинальную плату в Genetic Center Saint Ahadi.

Для максимальной синхронизации по возрасту исследуемой популяции предпочтительно начать с синхронизированного родительского поколения. За неделю до начала анализа паралича исследуемой популяции с помощью платиновой вирм-пипетки перенесите от 20 до 30 взрослых особей на несколько 10 сантиметровых чашек с NGM-средой.

Рассейте вместе с OP 50 для двухчасовой откладки яиц при 16 °C, что является пермиссивной температурой для CL 4 1 76. Удалите взрослых особей GR и дайте потомству расти в течение семи дней, к концу которых они станут взрослыми особями второго дня гравидности. Второй день гравидности.

Для подготовки возрастных синхронных тестовых популяций для каждого экспериментального условия используются взрослые особи. Цель состоит в том, чтобы с помощью платиновой петли для червей подготовить три повторяемости планшетов, содержащих от 50 до 75 возрастных синхронных червей. Перенесите 10–12 взрослых особей второго дня жизни на 60-миллиметровые чашки с NGM, засеянные OP 50. Позвольте червям отложить яйца при 16 °C в течение двух часов, затем удалите взрослых особей и дайте яйцам вылупиться и вырасти при 16 °C.

На данном этапе рекомендуется, чтобы кодирование планшетов выполнял человек, не участвующий в их оценке, чтобы подсчет результатов был «слепым» по отношению к условиям эксперимента. Стадия эмбрионального развития яиц на момент их откладки (которая для червей дикого типа в оптимальных условиях составляет примерно 26-клеточную стадию) зависит от возраста и питания взрослых особей. Если используемые для откладки яиц взрослые особи старше или подвергались голоданию, будут откладываться яйца на более поздних стадиях развития, что сделает невозможным получение синхронной популяции и, следовательно, повлияет на кинетику анализа паралича.

Крайне важно использовать моногенные бактериальные культуры, такие как e coli, OP 50, поскольку любое бактериальное загрязнение может серьезно повлиять на данный анализ. Воспроизводимость будет максимальной, если в ваших трех повторностях на чашках будет примерно одинаковое количество червей. Для индукции трансгена и проведения анализа на паралич перенесите чашки в термостат при температуре 25 °C.

Через 48 часов после окончания синхронной откладки яиц черви должны находиться на третьей личиночной стадии. Пластины следует расположить в инкубаторе при температуре 25 °C без штабелирования, чтобы они прогрелись до этой температуры. Одновременно с этим следует начать оценку паралича червей через 18–20 часов после начала повышения температуры.

К этому моменту все черви в популяции должны достичь четвертой личиночной стадии; продолжайте проводить оценку с интервалом в два часа до тех пор, пока все черви на каждой из чашек не будут парализованы. По неизвестным причинам паралич распределяется по длине тела неравномерно. Область головы прекращает движение последней.

Таким образом, черви, у которых недавно начался паралич, не могут перемещаться по чашке, но могут двигать головой, расчищая бактерии вокруг переднего конца тела и оставляя вокруг себя ореол очищенного пространства. Такие черви неизбежно перейдут в состояние полного паралича, поэтому черви с ореолами характеризуются как парализованные. Некоторые черви не будут иметь ореолов, но также не будут проявлять спонтанных движений.

Их проверяют, аккуратно касаясь червя picked-инструментом (worm picker). Если при таком воздействии червь не способен на полноценное распространение волны по всему телу, для эффективности подсчета он также оценивается как парализованный. Проще всего переместить парализованных червей в незаполненный сектор чашки, чтобы они случайно не были подсчитаны повторно в следующий период оценки.

Это также позволяет ошибочно классифицированным червям проявить подвижность, что дает возможность скорректировать оценку для построения кривой паралича. В каждой временной точке доля непарализованных червей на каждой чашке пересчитывается в проценты, и средний процент непарализованных особей откладывается по оси ординат в зависимости от времени, прошедшего с момента начала повышения температуры. Полученная кривая формально аналогична кривой выживаемости и, следовательно, может быть проанализирована с использованием стандартных непараметрических методов статистики выживаемости.

Перевод трансгенных червей myo-3-Aβ на более богатую среду должен быть осуществлен к середине стадии L4, чтобы начался процесс паралича. Промотор Myo-3 регулируется в зависимости от стадии развития. После того как черви достигают поздней стадии L4 или взрослого состояния, уровень экспрессии значительно снижается.

Экспрессия трансгена блокируется при голодании червей, поэтому крайне важно, чтобы они были хорошо накормлены на протяжении всего эксперимента. Мы никогда не наблюдали восстановления парализованных червей ни при каких условиях. Через 12–16 часов после повышения температуры (Upshift) черви штамма CL 41 76 будут парализованы; это произойдет даже в том случае, если вы снизите температуру до 16 градусов, так как в штамме CL 41 76 ап-регуляция экспрессии трансгена, вызывающая паралич, может происходить и при более низких температурах.

Однако, пожалуйста, обратите внимание, что время наступления паралича будет различаться. Скорость развития паралича зависит от конкретного трансгенного штамма. Мы создали три штамма myo A beta, у которых скорость развития паралича выше или ниже, чем у CL 41 76, поэтому вам необходимо соответствующим образом скорректировать временной интервал оценки при проведении анализа на паралич.

Здесь представлен график кривой паралича для CL 4 1 76 как в контрольной группе, так и при воздействии 6.27 millimolar кофеина. Данная обработка приводит к статистически значимой задержке паралича примерно на четыре часа, что, по нашему мнению, указывает на подавление бета-токсичности. В рамках данной модели этот эксперимент позволил оценить воздействие еще одного соединения, содержащегося в кофе.

График является типичным для вариантов обработки, которые не влияют на бета-токсичность. Обратите внимание, что в обоих экспериментах около половины необработанных популяций CL 4 1 76 парализованы к 24 часам, а к 28 часам паралич становится полным. Это типичные временные рамки для паралича контрольной группы.

Значительные отклонения в сроках для популяций CL 4 1 7 6 указывают на изменение условий окружающей среды или спонтанную делецию копий трансгена. Дополнительную информацию о штамме CL 4 1 76 см. в прилагаемом протоколе. При выполнении данной процедуры важно учитывать возраст чашек, стадию развития популяции червей и возможность оценки степени их паралича.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться четкое представление о том, как использовать систему с морскими нематодами для тщательного анализа токсичности бета-амилоида. Вы сможете обнаруживать довольно тонкие эффекты воздействия различных факторов окружающей среды или лекарственных препаратов на эту токсичность. Переменные, которые мы обсудили, требуют особого внимания, так как это позволит вам проводить анализ с высокой воспроизводимостью и стабильной кинетикой паралича.

Это на самом деле весьма важно, если вы хотите сравнить результаты, полученные в вашей лаборатории в разное время разными людьми, или сравнить свои результаты с данными других исследователей, использующих эту модельную систему.