Применение допамина Элеганс C. Анализ дегенерация нейронов для проверки потенциальных болезни Паркинсона Гены

В лаборатории Колдвелла, также известной как «Червячный сарай», мы изучаем механизмы неврологических заболеваний у C. elegans. И после долгого дня плодотворных экспериментов мы вознаграждаем себя каким-нибудь развлекательным занятием. Здравствуйте, я Адам Найт, студент бакалавриата из лаборатории Колдвелла факультета биологических наук Университета Алабамы.

Сегодня мы продемонстрируем, как проводить анализ дегенерации дофаминовых нейронов у C. elegans. Я проведу скрещивание штамма червей с нейродегенерацией дофаминовых нейронов с трансгенными штаммами, в которых сверхэкспрессированы гены-кандидаты, связанные с заболеванием, и дофаминовые нейроны. Здравствуйте, я Адам Харрингтон, аспирант лаборатории Колдвелла.

Сегодня я покажу вам, как подготовить трансгенных червей для анализа дофаминергических нейронов. Здравствуйте, меня зовут Шу Амичи, я аспирант. В данном видео я продемонстрирую, как проводить анализ дофаминергических нейронов C. elegans, которые называются CEP и ADE.

Как правило, черви, экспрессирующие только GFP в дофаминергических нейронах, не проявляют признаков гибели клеток. Однако в присутствии CLE вы сможете наблюдать такие процессы, а также возрастную нейродегенерацию. С помощью этого метода можно коэкспрессировать трансген в дофаминергических нейронах, чтобы определить, способен ли он усиливать или подавлять токсичность, индуцированную CLE. Итак, приступим.

Перед проведением анализа дофаминергических нейронов необходимо скрестить соответствующие штаммы GaN, чтобы поместить на спаривательную пластинку восемь червей, экспрессирующих как alphas nucle, так и GFP под контролем специфичного для дофаминергических нейронов промотора dat one. Теперь добавьте двух трансгенных C. elegans на стадии L4, которые демонстрируют специфическую экспрессию нашего исследуемого гета-кандидата в дофаминергических нейронах, а также экспрессию флуоресцентного селективного маркера DS red two в клетках мышц теловой стенки. Важно отметить, что для каждой трансгенной конструкции мы создаем три стабильные трансгенные линии.

Таким образом, данный генетический скрещивание следует проводить индивидуально для каждой из трех созданных отдельных стабильных линий. Через два дня удалите самцов, а еще через два-три дня утилизируйте их. Осмотрите поколение F1.

Появилось несколько мужских потомков, что свидетельствует об успешном скрещивании. Затем индивидуально перенесите на новые чашки по четыре особи из каждого скрещивания Aphrodite L4, которые экспрессируют как флуоресцентный маркер GFP, унаследованный от отца, так и флуоресцентный маркер мышц телостной стенки DS red 2, унаследованный от родителя hamadi. Переносимые животные должны находиться на стадии L4, чтобы гарантировать, что они еще не вступили в период гермафродитизации.

При наличии самцов на чашке дайте животным самооплодотворяться в течение трех-четырех дней для получения потомства F2. Теперь следует отобрать потомство F2: перенесите от пяти до десяти особей, имеющих оба центромерных маркера, на отдельные индивидуальные чашки.

Затем проведите скрининг поколения F3, чтобы выявить планшеты, в которых сто процентов животных экспрессируют GFP в дофаминергических нейронах, а некоторые из них экспрессируют флуоресцентный маркер DS red two в клетках мышц тела. Такие животные будут гомозиготны по генам альфа-синуклеина и GFP, а также будут стабильно передавать недавно созданный трансген. После завершения скрининга можно приступать к анализу дофаминергических нейронов.

Для начала анализа нейронов подготовьте свежие чашки с животными трех линий, определенными на предыдущем этапе. Подготовьте по одной чашке для каждой из трех трансгенных линий. Кроме того, в качестве контроля используйте штамм с экспрессией только alpha-synuclein GFP; дайте червям вырасти до взрослого состояния.

Когда черви достигнут взрослого состояния, перенесите от 30 до 40 трансгенных животных каждой линии на свежую чашку. Дайте им отложить яйца в течение пяти часов при 20 °C. Через пять часов удалите и утилизируйте животных.

Взрослых особей содержат до развития эмбрионов в течение трех-четырех дней при 20 °C до достижения ими стадии L4. Затем примерно сто трансгенных животных на стадии L4 переносят на чашку с 0,04 mg/mL 5-фтор-2'-дезоксиуридина.

Этот нуклеотидный аналог предотвращает развитие следующего поколения путем ингибирования синтеза ДНК. Поскольку чашки с FDUR светочувствительны, защищайте их от света, храня чашки под крышкой и полностью обернув их. Подготовьте агарозный пад для анализа червей.

Используйте эти материалы свежими, не допуская их высыхания. Подготовьте два предметных стекла, на которых вдоль наклеена полоска скотча. Скотч служит разделителем для создания подушек одинаковой толщины.

Положите между ними на стол третье предметное стекло. Теперь они расположены в ряд. Три штуки бок о бок.

Поместите каплю расплавленного агароза в центр предметного стекла и быстро накройте его другим стеклом перпендикулярно первому, чтобы зафиксировать все три стекла. Повторите процедуру, подготовив столько дополнительных агарозных подушечек, сколько потребуется для анализа всех образцов. После подготовки агарозных подушечек нанесите каплю 6 µL 3 мM анестетика в составе 11-миле и saw на покровное стекло размером 22 × 30 мм.

Перенесите 40 взрослых особей в каплю, затем переверните покровное стекло на агарную подушечку. Повторите процедуру для каждой из остальных линий. Проведите подсчет у 30 особей каждой линии на наличие каждого CEP-нейрона и D-нейрона.

Используя составной микроскоп с эпифлуоресценцией и фильтром, позволяющим визуализировать FITC или GFP, мы будем использовать фильтр-куб endo G-F-P-H-Y-Q и записывать данные в оценочный лист. Животные дикого типа сохраняют полную экспрессию GFP в четырех нейронах CEP и двух нейронах A DE. Отдельные животные с потерей нейронов D классифицируются как дикий тип или дегенерирующие.

Эти нейроны регистрируют как LG или потерю GFP. Аналогично, степень дегенерации можно оценить, подсчитав общее количество погибших нейронов в каждом животном, а также популяцию; анализ повторяют еще дважды, используя по 30 дополнительных животных на каждую линию в каждом опыте.

Вычисляют среднее общее количество червей с дофаминергическими нейронами дикого типа по трем раундам анализа. Статистический анализ нейропротекции затем проводят с использованием t-критерия Стьюдента при значении P менее 0,05. Для сравнения контрольных червей со штаммами, в которых происходит гиперэкспрессия генов-кандидатов в дофаминергических нейронах, проводят данный анализ в разные дни после откладки яиц; соответствующие дни анализа определяют эмпирически.

Например, нами было установлено, что 77%, 87% и 90% животных с alpha CLE плюс GFP имеют дегенерированные дофаминергические нейроны на шестой, седьмой и десятый дни после развития соответственно. Следовательно, если мы предполагаем, что интересующий нас трансген может усилить нейродегенерацию, анализ будет проводиться на шестой день. Аналогично, трансгены, которые могут подавлять нейродегенерацию, будут анализироваться на седьмой и десятый дни.

Мы только что продемонстрировали, как проводить анализ нейродегенерации дофаминергических нейронов у C. elegans. При выполнении данной процедуры важно помнить следующее: во-первых, используйте подходящий маркер для селекции при генетических скрещиваниях; во-вторых, для скрещиваний используйте здоровых самцов и личинок стадии L4.

И третье, обязательно тщательно и последовательно проводите подсчет нейронов CEP и DE. Эта процедура позволит вам быстро оценивать генетические факторы, которые могут усиливать или подавлять нейродегенерацию, индуцированную alpha alpha CLE. На этом всё.

Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.