Кристаллизации белков для рентгеновской кристаллографии

Общая цель данной процедуры заключается в получении кристаллов белка для экспериментов по рентгеновской дифракции. Продемонстрированы три различных метода скрининга кристаллов: методы кристаллизации путем диффузии пара, включая метод висячей и сидячей капли, а также микроbatch-метод кристаллизации. Лунки заполняют осадителем.

Затем образец очищенного белка высокой концентрации смешивают с осадителем. Смешанную каплю запечатывают в лунке, содержащей раствор осадителя. Микропакетная кристаллизация начинается с заполнения лунки парафиновым маслом.

Затем белок наносят в лунки, после чего добавляют раствор осадителя. Заключительным этапом всех методов является уравновешивание системы и наблюдение за появлением и ростом кристаллов внутри капель. В конечном итоге с помощью данной методики можно получить кристаллы и определить дифракционную картину белка, используя источник рентгеновского излучения с подходящим детектором.

Здравствуйте, меня зовут Сол, я из лаборатории профессора Йоги Мотиса кафедры молекулярной биофизики и биохимии Йельского университета. Сегодня мы продемонстрируем вам процедуру кристаллизации очищенного белка. Мы используем этот метод в нашей лаборатории для изучения структурных основ вирусной инфекции.

Итак, приступим к выращиванию кристаллов. Чтобы определить метод кристаллизации для выбранной макромолекулы, можно провести первичный скрининг с использованием коммерчески доступных растворов для кристаллизации, подобранных для применения метода неполного факториала в разреженной матрице условий опыта. Эти условия выбираются на основе известных и часто успешных условий кристаллизации макромолекул.

После определения условий кристаллизации можно провести более детальный скрининг, варьируя концентрацию осадителя при значениях pH, близких к первоначально найденному варианту. Обычно условия кристаллизации, используемые для таких скринингов, включают осаждающий агент и буфер для установления pH; для данной демонстрации все стоковые растворы должны быть профильтрованы через фильтр с размером пор 0,22 мкм. В качестве условий кристаллизации для лизосом курицы используется хлорид натрия в качестве осадителя; начните процедуру с приготовления растворов по 1 мл различных концентраций хлорида натрия в 0,1 М ацетате натрия при различных значениях pH.

Затем разморозьте образец белка, который хранится при -80 °C, и держите его на льду. Типичные концентрации белка находятся в диапазоне от 5 до 50 mg/mL, причем более высокие концентрации обычно дают лучшие результаты. В данной работе используется раствор лизоцима куриного яйца с концентрацией 50 mg/mL в 0,02 M ацетате натрия при pH 4,9.

Центрифугируйте образец в течение 15 минут при 18 000 G и четырех градусах Цельсия, чтобы удалить частично агрегированные белки или осадок, образовавшийся на этапе размораживания. Эти агрегаты могут препятствовать росту кристаллов и способствовать дальнейшей агрегации. После центрифугирования.

Определите концентрацию белка по его поглощению при 280 нанометрах с помощью УФ-спектрофотометра. Концентрацию белка можно рассчитать на основании показателя поглощения и коэффициента экстинкции белка. После подготовки образца белка заполните 24-луночный планшет для кристаллизации методом висячей капли 500 µL раствора осадителя согласно схеме планшета.

Нанесите кольцо из силиконовой смазки по краю каждой лунки, не замыкая его полностью, чтобы воздух мог выходить через верхнюю часть лунки. Очистите покровное стекло с помощью спрея со сжатым воздухом или профессиональной салфетки, чтобы избежать попадания пыли; это облегчит интерпретацию капель кристаллизации и исключит загрязнения. Следующим шагом является нанесение на покровное стекло равных объемов образца белка и резервуарного раствора с помощью пипетки.

Тем не менее, в процессе оптимизации можно пробовать различные объемы белка и осадителя; использование большего количества белка по сравнению с осадителем приводит к увеличению итоговой концентрации белка в уравновешенной капле, что может быть целесообразно для разбавленных образцов белка или для замедления нуклеации или роста кристаллов. В данной демонстрации в центр покровного стекла вносят 2 µL лизоцима в концентрации 50 mg/mL в 0,02 M растворе ацетата натрия (pH 4), после чего добавляют 2 µL кристаллизационного раствора.

При нанесении белка и раствора резервуара на покровное стекло соблюдайте крайнюю осторожность, чтобы избежать образования пузырьков, которые часто возникают при выдувании воздуха из пипетки. Осторожно перемешайте каплю, чтобы предотвратить преждевременное осаждение белка из-за локально высоких концентраций осадителя в капле; перемешивание особенно важно при использовании вязких осадителей, таких как полиэтиленгликоль, с помощью пинцета. Осторожно переверните покровное стекло и положите его на кольцо из вазелина поверх лунки; выполняйте это движение направленно, чтобы воздух мог выйти из лунки.

В противном случае воздух может приподнять покровное стекло, что нарушит герметичность лунки. Повторите процедуру для следующих лунок до заполнения всего планшета. После подготовки планшета визуально осмотрите его, удалив частицы пыли и другие загрязнения, которые могут привести к ложноположительной идентификации белковых кристаллов.

Используйте оценочный лист для документирования эксперимента. Затем поместите лоток при заданной температуре инкубации, которая обычно составляет от 4 °C до комнатной температуры. Наиболее подходящая температура — 20 °C.

При работе с планшетом следует соблюдать осторожность: избегайте встряхивания, вибраций и перепадов температуры во время переноса или инкубации, так как это может препятствовать росту кристаллов или негативно повлиять на их качество. Проверяйте наличие кристаллов в планшете на следующий день, а затем каждые несколько дней, неизменно соблюдая осторожность при обращении с планшетами. Документируйте все результаты и морфологию капель в специальном листе оценки для каждого планшета.

Кристаллы обычно появляются через два-пять дней, хотя иногда они могут возникнуть почти мгновенно или спустя несколько месяцев. Как только условия кристаллизации определены и скорость роста кристаллов известна, лотки рекомендуется оставить в покое до появления кристаллов и их роста как минимум до половины конечного размера. Отсутствие внешних воздействий на лотки может снизить количество актов нуклеации, что приведет к образованию меньшего числа более крупных кристаллов. При кристаллизации методом сидячей капли следует придерживаться той же процедуры, что и для висячей капли, за исключением того, что используется 24-луночный лоток для сидячих капель, в котором покровные стекла не требуются.

Вместо этого лунка имеет платформу, на которой смешиваются белок и осадитель: с помощью пипетки нанесите 2 µL раствора лизоцима с концентрацией 50 mg/mL в центр платформы, избегая образования пузырьков воздуха. Затем, после установки планшета, добавьте 2 µL раствора осадителя к образцу. Запечатайте лунки с сидячей каплей с помощью оптической ленты.

Покрывные стекла не требуются. Продолжите инкубацию и оценку кристаллов, как описано для метода висячей капли. Для выполнения процедуры микропартии.

Подготовьте кристаллизационный раствор и белок согласно описанию для метода висячей капли. Возьмите новый планшет для микропакетного метода и обработайте его сжатым воздухом, чтобы избежать попадания пыли и других крупных частиц в лунки. Добавьте в каждую лунку парафиновое масло так, чтобы его глубина составляла три миллиметра.

Затем удалите излишки масла. После этого внесите 1 µL раствора белка в предварительно заполненную лунку, убедившись, что капля опустилась на дно. Затем внесите в лунку 1 µL раствора осадителя.

Убедитесь, что капля опустилась на дно лунки и слилась с каплей белка. Перейдите к следующей лунке, пока весь планшет не будет заполнен, затем приступайте к инкубации и анализу кристаллов, как описано здесь. Типичные результаты кристаллизации белка.

Представлены результаты экспериментов. Аморфное осаждение происходит при высоких концентрациях белка и/или осадителя. Напротив, ненасыщенные капли обычно остаются прозрачными.

Фазовое разделение может произойти, если белок или детергент переходит в другую фазу при смешивании с определенными осадителями в высокой концентрации. При оптимальных условиях должны образоваться кристаллы белка Arabidopsis csn. Семь кристаллов белка, полученных в полиэтиленгликоле 8 000 и ацетате магния, имеют стержневидную форму.

Также представлены кристаллы белков лизосом, которые были получены в одном молярном растворе хлорида натрия и ацетата натрия при pH 4.9. Этот таймлапс-фильм демонстрирует, что кристаллы лизосом вырастают в крупные призмы в течение нескольких часов после постановки при использовании метода «висячей капли».

Мы только что продемонстрировали вам, как подготовить эксперимент с белками при выполнении данной процедуры. Важно работать в условиях стабильного контроля температуры и влажности, так как высокая влажность помогает минимизировать испарение капли; старайтесь использовать технику, которая сводит к минимуму воздействие открытого воздуха на каплю. По этой причине крайне важно поддерживать строго организованную рабочую среду.

На этом все. Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.