Стабильный Изотопный Профилирование посредник Flux Метаболический в развивающихся странах и взрослой стадии Caenorhabditis Элеганс

Общая цель следующего эксперимента заключается в неинвазивном мониторинге в режиме реального времени метаболических изменений на уровне всего организма в процессах гликолиза, метаболизма пирувата и цикла трикарбоновых кислот, вызванных отдельными метаболическими путями, генетическими изменениями и/или фармакологическим воздействием. Это достигается путем введения стабильных изотопов живым нематодам для обеспечения достаточного изотопного обогащения более широкого спектра метаболитов, что позволяет количественно оценить генетические и/или фармакологические изменения в промежуточных метаболических путях. На втором этапе с помощью газовой масс-спектрометрии измеряется включение изотопов в атмосферный и растворенный углекислый газ, что обеспечивает более прямую оценку промежуточного метаболического потока за короткие промежутки времени.

Далее образцы подвергаются анализу общего содержания свободных аминокислот в червях с помощью ВЭЖХ, а также анализу изотопного обогащения аминокислот и органических кислот методом ГХ-МС для количественной оценки изменений метаболического потока у нематод. После воздействия стабильных изотопов были получены результаты, демонстрирующие влияние различной продолжительности изотопного воздействия, очистки от бактерий и альтернативных способов разрушения червей дикого типа для изучения изотопного содержания в промежуточных метаболитах. Данный метод позволяет получить представление о состоянии промежуточного метаболизма.

Данный метод также может быть применен к таким нашим системам, как клеточные линии млекопитающих и ткани. Впервые идея этого метода возникла у нас, когда при анализе свободных аминокислот червей с помощью HPLC мы заметили постоянные отклонения, которые указывали на нарушение промежуточного метаболического потока при первичных изменениях респираторной функции. Для начала данной процедуры.

Червей, подвергавшихся воздействию метаболического предшественника, меченого стабильным изотопом, либо в процессе развития, либо во взрослом состоянии, собирают в пластиковую центрифужную пробирку объемом 1,5 мл. Обычно мы доводим концентрацию червей до 1000 особей на 1 мл. К червям добавляют 60% перхлориную кислоту, содержащую эпсилон-аминокапроновую кислоту в качестве внутреннего стандарта, до конечной концентрации 4% перхлориной кислоты и 20 нМ внутреннего стандарта.

Дайте червям осесть под действием силы тяжести в течение пяти минут, затем удалите и сохраните супернатант в другой пробирке. Следующий этап является одним из наиболее критических аспектов данной процедуры. Перед анализом свободных метаболитов черви должны быть полностью разрушены путем гомогенизации. С помощью пластического гомогенизатора и электрической дрели измельчайте образцы червей в течение 15 секунд.

Визуально подтвердите разрушение червей с помощью световой микроскопии и при необходимости повторите растирание. На данном изображении на панелях A и B показаны черви до растирания. В отличие от панелей C и D, на которых черви показаны после растирания, перенесите ранее сохраненный супернатант в пластиковые центрифужные пробирки объемом 1.5 milliliter с гомогенатом червей в центрифуге.

Центрифугируйте образцы при 2 250 RPM (1300 Gs) в течение пяти минут. После центрифугирования перенесите супернатант в новую стеклянную пробирку объемом семь миллилитров. Сохраните осадок для последующего использования в анализе концентрации белка.

Теперь добавьте четыре нормальный раствор гидроксида калия в супернатант, пока диапазон pH образцов не достигнет семи-восьми, и центрифугируйте. Нейтрализованные образцы в стеклянных пробирках объемом семь миллилитров центрифугируют при 2 250 об/мин (1300 G) в течение пяти минут. Для удаления солей перенесите супернатант из каждого образца в новую стеклянную пробирку объемом семь миллилитров. Теперь нейтрализованные образцы можно подготовить к количественному определению метаболитов с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) или газовой хроматографии-масс-спектрометрии (ГХ-МС). Для ВЭЖХ.

Отберите по 50 µL каждой нейтрализованной пробы для прямого ввода в ВЭЖХ. Количественное определение свободных аминокислот проводят с помощью предварительной дериватизации альдегидом и флуоресцентного детектирования. Как было описано ранее, остальные нейтрализованные пробы будут подвергнуты экстракции с использованием ионообменной смолы для ГХ-МС с целью определения изотопного обогащения аминокислот и органических кислот, как показано в следующем разделе.

Для подготовки гранул добавьте 1 N раствор соляной кислоты отдельно к гранулам G 1 и G 50. В стаканах объемом 1 л перемешивайте содержимое каждой колбы в течение 30 минут с помощью магнитной мешалки. После этого промойте гранулы деионизированной водой 10 раз, пока pH промывных вод не станет равен pH воды.

Далее мы продемонстрируем метод изготовления недорогих колонок по индивидуальному заказу с использованием стеклянных пипеток. Готовые колонки также доступны в коммерческой продаже. Чтобы подготовить колонку, с помощью пинцета вставьте хлопковую пробку чуть выше самой узкой части кончика пастеровской пипетки, используйте сорбент G 1 для экстракции органических кислот и сорбент G 50.

Для экстракции аминокислот заполните каждую колонку примерно на одну треть ее высоты. Если образец уже имеет нейтральный pH, перед нанесением его на колонку AG 1 в образец ничего не добавляют. Для экстракции органических кислот с целью последующего выделения аминокислот добавьте в образец один миллилитр 0,1 н. соляной кислоты перед нанесением его на колонку AG 50.

Теперь нанесите ранее подготовленные нейтрализованные образцы на каждую колонку. Промойте каждую колонку водой 10 раз до достижения нейтрального значения промывных вод. После завершения промывки элюируйте содержимое каждой колонки в чистые промаркированные стеклянные пробирки объемом 4 мл. Для экстракции органических кислот добавьте в колонку AG 1 три миллилитра 3Н раствора соляной кислоты.

Это позволяет проводить анализ изотопного обогащения по общему количеству меченых атомов углерода для соединений с тремя, четырьмя, пятью и шестью атомами углерода. Для экстракции аминокислот добавьте 3 мл 4Н раствора гидроксида аммония в колонку G 50. Это позволяет проводить анализ изотопного обогащения по общему количеству меченых атомов углерода для соединений с тремя и пятью атомами углерода.

После завершения экстракции как органических кислот, так и аминокислот, поместите пробирки с образцами в эвапоратор App three на ночь до полного высыхания. Затем образцы подвергают дериватизации и анализируют с помощью ГХ-МС, как подробно описано в тексте протокола. Начните выполнение данной процедуры с переноса тысячи молодых взрослых червей на экспериментальную чашку NGM диаметром 35 мм, содержащую глюкозу с универсальной меткой по углероду 13 и E. coli.

Затем поместите экспериментальную чашку с NGM без крышки в специальную стеклянную камеру, оснащенную герметичным трехходовым краном для обеспечения точного отбора проб и замены атмосферы. Смажьте вакуумной смазкой место уплотнения, где optically transparent стеклянный диск прилегает к чашке.

Герметично закройте камеру стеклянным диском. Зафиксируйте время. Спустя 30 минут, приняв это за нулевую отметку времени, с помощью шприца объемом 20 миллилитров отберите 10 миллилитров атмосферы из стеклянной камеры через трехходовой вентиль.

Закройте кран, ведущий в камеру. После отбора пробы перенесите образец в вакуумную стеклянную пробирку с красной крышкой, содержащую 1 мл бикарбоната натрия в 0,1 M растворе гидроксида натрия. Затем с помощью трехходового крана введите 10 мл воздуха в стеклянную камеру. Используя шприц объемом 20 мл, закройте кран, ведущий в камеру. После повторного введения воздуха и перед возобновлением инкубации повторите отбор проб атмосферы из стеклянной камеры через 60, 90 и 120 минут.

Проанализируйте эти образцы атмосферного диоксида углерода на обогащение меченым углеродом с помощью газового масс-спектрометра с определением соотношения изотопов, как описано в тексте протокола. Стабильные изотопы хорошо встраиваются в ткани молодых взрослых червей через два часа, о чем свидетельствует содержание меченого углерода, измеренное в атмосферном диоксиде углерода и растворенном диоксиде углерода в червях, которых кормили либо живыми, либо убитыми УФ-облучением клетками OP 50 e coli. Соотношение 13C-диоксида углерода к 12C-диоксиду углерода было выше во фракции растворенного диоксида углерода в червях по сравнению с высвобожденным атмосферным диоксидом углерода. Было замечено, что длительное воздействие стабильного изотопа начиная с личиночного периода с последующим содержанием червей на среде NGM без бактерий приводило к увеличению изотопного обогащения свободного глутамата у молодых взрослых червей.

На этом графике L1 обозначает червей, которых кормили глюкозой с универсально меченным углеродом 13 и бактериями OP50 с личиночной стадии L1 по стадии молодого взрослого организма 959 cell; YA обозначает червей, которых кормили глюкозой с углеродом 13 и бактериями OP50 в течение 48 часов, начиная с первого дня стадии яйцекладки молодых взрослых особей. Ось X показывает общее количество меченых атомов углерода в каждом виде глутамата, а ось Y показывает процент обогащения. Перед последующей подготовкой образцов из всех животных удаляли избыток изотопной метки.

Для ГХ-МС анализа зеленые столбцы обозначают червей, очищенных после изотопного воздействия путем кормления штаммом OP 50 E. coli на чашках с NGM в течение двух часов перед экстракцией PCA. Синие и серые столбцы обозначают червей, очищенных после изотопного воздействия на чашках с NGM без бактерий в течение двух или шести часов соответственно перед экстракцией PCA, независимо от временного интервала изотопного воздействия. Значимых различий в изотопном обогащении промежуточных метаболитов при очистке животных на чашках в течение двух или шести часов не наблюдалось.

В обоих курсах изотопного воздействия наблюдалось меньшее изотопное обогащение промежуточных метаболитов в тех случаях, когда очистка животных проводилась путем кормления немаркированными бактериями в течение двух часов. Таким образом, было установлено, что оптимальный протокол очистки для червей, выращенных на чашках NGM с бактериальным посевом и изотопом, заключается в очистке в течение двух часов на чашках NGM без посева для оптимизации процента обогащения промежуточных метаболитов. После этого следовала обработка в жидкой культуре в течение 24 часов с использованием глюкозы с одним углеродом 13 из шести без добавления бактерий.

На данном рисунке представлено сравнение образцов червей, разрушенных только с помощью соникации, или путем соникации в сочетании с растиранием. Образцы, подвергнутые соникации и растиранию, продемонстрировали большее изотопное обогащение, чем образцы, разрушенные только соникацией; в конечном итоге живых червей скармливали стабильным изотопным предшественником либо в процессе развития, начиная со стадии L1 на чашках, либо начиная с первого дня откладки яиц в качестве молодых взрослых особей в течение 24 часов в жидкой культуре. Это позволило провести чувствительный анализ изотопного обогащения метаболитов, указывающих на поток через гликолиз и метаболизм пирувата в цикле трикарбоновых кислот после его развития.

Данная методика открыла возможности для исследования промежуточного метаболического потока у C. elegans в рамках изучения митохондриальных заболеваний. После просмотра этого видео вы должны будете четко понимать, как проводить профилирование промежуточного метаболизма и метаболического потока с помощью стабильных изотопов у нематод C. elegans.