Основной

В этом видео мы покажем вам, как синхронизировать развитие C. elegans на стадии L1. Это простой, но очень распространенный метод, поэтому он будет весьма полезен, если вы только начинаете работу.

Если вы являетесь экспертом по C, здесь вы можете найти несколько советов по оптимизации данного протокола. Принцип синхронизации червей основан на относительной устойчивости эмбрионов по сравнению с взрослыми особями к раствору гипохлорита натрия. Взрослые черви, содержащие большое количество эмбрионов, инкубируются в растворе гипохлорита, в результате чего взрослые особи погибают, а эмбрионы выживают.

Вторая часть синхронизации достигается за счет отсутствия пищи, благодаря чему, даже если эмбрионы вылупляются в разное время, они не развиваются дальше стадии L1. Первым шагом для начала протокола «блитцинга» является доведение червей до стадии откладки яиц, при которой на чашке рассыпано несколько яиц. Используйте среду M9 для восстановления взрослых особей перед сбором.

Кроме того, эмбрионы, которые уже находятся на поверхности чашки, можно собрать, соскребая их мягким материалом, например, фрагментом рентгеновской пленки, и промыть несколько раз в среде M9 для удаления остатков бактерий. Обычно достаточно двух промывок. После того как черви будут промыты, следует добавить свежеприготовленный раствор для обесцвечивания в соответствии с выбранным протоколом.

Контролируйте время инкубации, встряхивая пробирку. Вы можете наблюдать за появлением взрослых особей под стереомикроскопом. Как только количество трупов станет минимальным, остановите реакцию, добавив M nine до полного заполнения пробирки.

Для завершения протокола выполните не менее трех промывок. Яйца инкубируют в буфере M9 в течение ночи при постоянном встряхивании, что позволяет им вылупиться, но предотвращает дальнейшее развитие червей. Хотя синхронизацию можно проводить при любой температуре от 15 до 25 градусов, рекомендуется 15.

Поскольку развитие протекает медленнее, как упоминалось ранее, *C. elegans* проходит четыре личиночные стадии перед достижением взрослого состояния; время этого процесса зависит от температуры культивирования. Тип C *C. elegans* переносит температуры роста в диапазоне от 15 до 25 градусов, однако при этом скорость роста выше.

При более высокой температуре видно, что через 24 часа черви находятся на разных стадиях развития. При 15 и 25 градусах через 48 часов при 25 градусах мы уже наблюдаем эмбрионы. Однако, чтобы увидеть эмбрионы на поверхности планшетов, необходимо подождать более 80 часов.

Для достижения оптимальных результатов при выращивании червей при 15 °C в ходе эксперимента по блитцингу необходимо учитывать несколько факторов. Также важно уметь определять стадию развития червей, подходящую для проведения эксперимента. Поэтому мы покажем вам, как различать стадии развития по размеру, с помощью дифференциально-интерференционного контрастного микроскопа или метода окрашивания.

На этом графике можно оценить скорость роста червей GaN в зависимости от температуры; как видно, при 25 градусах они растут значительно быстрее. Существует корреляция между размером животного и стадией его развития в морской среде. С помощью соответствующего программного обеспечения можно измерить животных и затем классифицировать их по надлежащей стадии развития.

Однако, согласно данному графику, местоположение является лишь приблизительным маркером стадий развития. Более точное стадирование может быть достигнуто путем наблюдения за частями семенников — анатомическими структурами, которые можно распознать с помощью дифференциально-интерференционного контрастного микроскопа или окрашивания DPI. В нашей лаборатории данный протокол использовался для синхронизации червей в различных экспериментах, таких как микроинъекции яиц при моно-окрашивании, визуализация in situ и окрашивание AP.

Кроме того, данный протокол позволяет избавиться от загрязнений. Для повышения контрастности используется дифференциальный интерференционный контраст или номар-микроскопия. Неокрашенные прозрачные образцы с живыми животными монтируют на подложку из 2% Agros; раствор Agros можно приготовить заранее и хранить при температуре четырех градусов до востребования.

Его можно расплавить и поддерживать при температуре 65 °C. После того как агароз расплавится, наклейте кусочки скотча на предметное стекло и расположите их по обоим краям третьего предметного стекла. Осторожно возьмите немного агарозы и нанесите каплю на стекло без скотча.

Накройте агарозный слой другим предметным стеклом, расположенным поперечно. После затвердевания дорожки аккуратно раздвиньте два стекла, скользя одним по другому. Подушечка прилипнет к одному из них.

Добавьте немного амазона на подложку, чтобы зафиксировать червей. Выберите нескольких червей под диссекционным микроскопом и перенесите их в каплю леле, стараясь не повредить путь.

Возьмите покровное стекло и нанесите немного лака для ногтей по краям. Осторожно поместите предметное стекло на это стекло, предотвращая образование пузырьков воздуха. Препарат можно сразу же рассмотреть под микроскопом. Одной из самых простых для наблюдения особенностей анатомии C. elegans является глотка.

Например, larva с формой, напоминающей рождественскую елку, характерна для стадии L4. Подробную информацию об анатомии C. elegans в процессе развития можно найти на сайте www.orla.org. Окрашивание по Тапису — это общепринятая процедура для идентификации отдельных клеток.

Фиксация с использованием туннеля представляет собой быстрый метод фиксации червей. Для окрашивания DAPI сначала нанесите каплю буфера M9 на поверхность предметного стекла микроскопа. Перенесите нескольких червей непосредственно с чашки Петри в каплю буфера M9.

Удалите излишки M9 с помощью пипетки или мягкой салфетки. Перенесите червей в туннель. Повторите процедуру.

После высыхания первой капли добавьте немного среды для заключения с API и оверслипом, прежде чем переносить препарат под микроскоп. Развитие go можно легко наблюдать в теплом стенте с api.