Высокое разрешение Волоконно-оптические Microendoscopy для На месте Сотовые изображений

Традиционно биологические и клинические исследования, требующие микроскопического анализа с разрешением на клеточном уровне, проводились путем параллельного выполнения нескольких экспериментов с извлечением отдельных образцов из исследования в последовательные моменты времени для оценки с помощью световой микроскопии; в то время как конфокальная, многофотонная микроскопия и микроскопия второй гармоники являются полезными методами визуализации in situ. Необходимая инфраструктура сложна и дорога, так как включает сканирующие лазерные системы и сложные источники света. Здесь мы демонстрируем, как за один день собрать систему волоконно-оптического микроэндоскопа высокого разрешения, используя готовые стандартные компоненты стоимостью менее 5 000 долларов США.

Платформа обеспечивает гибкость в выборе разрешения изображения, поля зрения и рабочей длины волны. Сначала собирается простая рама эпифлуоресцентного микроскопа, предназначенная для размещения источника света, оптических фильтров, линз, волоконно-оптического пучка и CCD-камеры. Затем устанавливаются линзы для визуализации, которые формируют увеличенное изображение волоконно-оптического пучка на CCD-камере.

Затем устанавливается светодиодный (LED) источник с осветительной оптикой для обеспечения возбуждающего флуоресцентного света для образца. Наконец, с помощью собранного микроэндоскопа в режиме реального времени визуализируются детали клеточного уровня флуоресцентно меченых образцов, включая культуры in vitro, животные модели in vivo и людей. Основным преимуществом этого метода по сравнению с существующими, такими как конфокальная или мультифотонная микроскопия, является то, что он достаточно прост и недорог, что позволяет исследователям из самых разных областей быстро внедрить его и адаптировать под свои конкретные нужды.

Описанный здесь микроэндоскоп высокого разрешения следует рассматривать как базовую конфигурацию, допускающую несколько вариантов сборки и применения. При выборе компонентов для конкретной задачи учитывайте взаимосвязь между концентрацией флуорофора, освещением, вызывающим фотообесцвечивание, интенсивностью, чувствительностью камеры, усилением и временем экспозиции, характерную для флуоресцентной микроскопии. Данная платформа предназначена для использования с профлавином в качестве флуоресцентного контрастного агента, но может быть сконфигурирована для работы с другими флуоресцентными красителями.

Pro flavin представляет собой яркий краситель для ядер с пиками длин волн поглощения и испускания 445 нанометров и 515 нанометров соответственно. При использовании других контрастных агентов пользователю потребуется соответствующим образом подобрать фильтры возбуждения, испускания и дихроичные фильтры для сборки системы микроэндоскопа. Начните с соединения двух шестидюймовых стержней клетки с двумя 1,5-дюймовыми стержнями клетки, чтобы получить пару стержней длиной 7,5 дюйма. Вкрутите стержни в одну из сторон блока складного зеркала, затем установите зеркало диаметром один дюйм.

Затем вкрутите четыре стержня длиной 0.5 inch в противоположную грань блока складного зеркала. Наденьте куб-держатель на стержни каркаса длиной 7.5 inch через два нижних сквозных отверстия. Вкрутите стержни длиной two inch в боковую грань куба-держателя.

Используя адаптер с креплением C-mount на SM1, закрепите камеру на пластине каркаса. Установите пластину каркаса на каркасные стержни диаметром 0,5 inch вровень с передней панелью блока складного зеркала. Выберите тубусный объектив диаметром one inch для формирования изображения волоконно-оптического пучка на камере.

Фокусное расстояние линзы следует выбрать таким образом, чтобы изображение пучка оптоволокна охватывало не менее двух пикселей. При установке перед камерой вставьте линзу в линзовую трубку длиной три дюйма и закрепите ее стопорным кольцом. Для завинчивания стопорных колец в длинные линзовые трубки удобно использовать гаечный ключ с зацепами.

Поместите эмиссионный фильтр в трехдюймовую линзовую трубку на первое стопорное кольцо и установите еще одно кольцо, чтобы зафиксировать фильтр на месте. Убедитесь, что ориентация фильтра соответствует рекомендациям производителя. Вкрутите линзовую трубку в боковую грань куба-корпуса, ближайшую к ПЗС-камере.

Это положение также показано здесь. Обратите внимание, что на схеме данная линза и фильтр изображены без трехдюймовой линзовой трубки. Для наглядности подключите камеру к компьютеру и просматривайте изображение на экране.

Направьте сборку в клетке на удаленный объект и перемещайте куб клетки вдоль направляющих до тех пор, пока изображение объекта не станет четким. С помощью отвертки затяните четыре винта, расположенных по бокам куба клетки. При затягивании эти винты фиксируют куб на направляющих.

Это обеспечит формирование туб-линзами сфокусированного изображения пучка волокон на камере при использовании объектива с поправкой на бесконечность. Затем вставьте дихроичное зеркало в держатель и установите его под углом 45 градусов в кубе клетки. Вкрутите объектив через переходник с резьбы RMS на SM1 и регулируемую линзовую трубку в грань куба клетки, противоположную держателю туб-линз.

После этого вкрутите SMA-разъем в пластину системы Cage и закрепите ее на стержнях примерно на рабочем расстоянии объектива. Установите базовую пластину и заглушку на открытые стороны куба системы Cage. Затем закрепите светодиод на пластине системы Cage и сдвиньте ее на конец двухдюймовых стержней.

Установите линзу в трубку для линз диаметром 0,5 дюйма таким образом, чтобы при ввинчивании этой трубки в боковую грань куба каркаса образовывалось изображение светодиода, заполняющее заднюю апертуру объектива. Также установите возбуждающий фильтр в трубку для линз. На данном этапе для управления интенсивностью освещения с помощью эпоксидного клея можно использовать драйвер светодиода.

Присоедините разъем SMA для волокна диаметром 1030 мкм к волоконно-оптическому жгуту с полем зрения 720 мкм. Для получения подробной информации о создании разъемов на оптических волокнах обратитесь к руководству Thorlabs (артикул FN 96) «Руководство по созданию разъемов и полировке оптических волокон».

Вкрутите пучок волокон с разъемом SMA в SMA-гнездо, установленное на стержнях каркаса. Направьте дистальный конец пучка в сторону широкополосного источника света (подойдет флуоресцентное освещение). Затем рассмотрите изображение проксимального торца пучка на CCD-камере. В завершение отрегулируйте положение объектива, вкручивая или выкручивая его из куба каркаса.

До тех пор, пока изображение пучка волокон не станет четким, отдельные волокна должны быть отчетливо видны. Пространственное разрешение микроэндоскопа можно увеличить, закрепив микролинзу или линзовый узел на дистальном конце пучка волокон. Данная оптика сконфигурирована таким образом, что вместо непосредственного прижатия конца пучка к ткани, изображение конца проецируется на поверхность ткани с определенным увеличением.

Тем самым увеличивается частота пространственного дискретизирования, обусловленная световодными свойствами пучка волокон. Степень увеличения dem соответствует повышению пространственного разрешения и, одновременно с этим, пропорциональному уменьшению поля зрения. Выберите линзу с градиентным показателем преломления (GRIN-линзу) с необходимым увеличением и рабочим расстоянием для вашего конкретного применения.

Убедитесь, что диаметр линзы соответствует диаметру используемого пучка волокон. Для точной юстировки установите пучок волокон и GRIN-линзу на отдельные ручные трехкоординатные позиционеры под микроскопом с малым увеличением или стереомикроскопом.

Затем нанесите каплю оптического клея либо на линзу, либо на торец пучка. С помощью ручных позиционеров совместите оба компонента так, чтобы они соприкоснулись. Подвергните интерфейс воздействию УФ-излучения в дозе, рекомендованной производителем, для отверждения клея.

Чтобы защитить градиентную линзу и склеенный интерфейс, используйте короткий отрезок алюминиевой капиллярной трубки для охвата соединения. Наденьте трубку на соединение и зафиксируйте ее каплей эпоксидного клея на каждом конце трубки, затем используйте термоусадочную трубку для завершения сборки. Перед проведением микроэндоскопической визуализации нанесите контрастное вещество на клетки или ткани, предназначенные для исследования, чтобы визуализировать клетки и культуру.

Сначала удалите питательную среду с помощью пипетки. Затем добавьте раствор профлавина, аккуратно внося его в лунку пипеткой. После короткой инкубации (до одной минуты) удалите раствор профлавина пипеткой и утилизируйте его.

Промойте клетки, добавив и затем удалив свежий раствор PBS из лунки; закрепите дистальный конец волоконно-оптического пучка в надежном зажиме с ручными позиционирующими столиками по осям x, Y, Z для обеспечения стабильности. Во время визуализации после нанесения красителя на клетки или ткань осторожно приложите волоконно-оптический пучок к образцу. Просматривайте изображение с волоконно-оптического пучка на экране компьютера, используя либо программное обеспечение от производителя камеры, либо любое специализированное ПО, которое вы решите разработать.

Отрегулируйте время экспозиции и усиление камеры, чтобы получить изображение приемлемой яркости. При правильной сборке микроэндоскоп будет работать как эпифлуоресцентный микроскоп, сигнал от которого передается через когерентный волоконно-оптический пучок. Для достижения оптимальных результатов визуализации следует убедиться в соблюдении трех основных условий.

Сначала необходимо получить изображение проксимального торца волоконного пучка на ПЗС-камере без дефокусировки, чтобы обеспечить максимальное разрешение системы. Здесь показаны фрагменты волоконного пучка при плохой, слабой и хорошей фокусировке. Оптимальный фокус достигается путем регулировки фактического положения объектива относительно торца пучка.

Во-вторых, проксимальный торец пучка волокон должен быть равномерно освещен по всему его диаметру. Как было описано ранее, это достигается путем настройки оптики освещения для коллимированного освещения. Представленное здесь изображение было получено при освещении однородного флуоресцентного образца в этой предпочтительной конфигурации.

Здесь показан соответствующий результат при критическом освещении. Структура светодиода проецируется на торец пучка волокон, что приводит к появлению этого нежелательного паттерна, наложенного на истинную структуру образца. В-третьих, важно убедиться, что и проксимальный, и дистальный торцы пучка волокон чисты и не имеют царапин и сколов.

В данном примере на торце пучка видны частицы загрязнений, а по периметру волокна на уровне пяти часов заметно повреждение в виде небольшого скола. Загрязнения с торцов пучка можно удалить, очистив их таким же способом, как и обычные волоконно-оптические разъемы, используя линзовую салфетку с изопропанолом или стандартные инструменты для очистки оптоволокна. 1483 клетки были помечены профлавином, после чего открытый пучок волокон осторожно поместили на образец.

Здесь представлена визуализация in vitro: при прикреплении GRIN-линзы с увеличением 2,5х к концу пучка волокон было достигнуто улучшение пространственного разрешения и уменьшение поля зрения. Как показано в этом видео, была выполнена визуализация in vivo, при которой пучок волокон с внешним диаметром 0,5 мм был введен через иглу 21-го калибра в ткань жировой подушки молочной железы мыши; отчетливо видны адипоциты, смещающиеся в соответствии с сердечным циклом. В данном примере была проведена визуализация слизистой оболочки полости рта здорового добровольца с использованием более крупного пучка волокон с внешним диаметром 1,5 мм.

Во всех примерах в качестве флуоресцентного контрастного агента для маркировки ядер использовался pro flavin. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как проектировать и собирать волоконно-оптический микроэндоскоп для флуоресцентной визуализации клеток и тканей in C two.