Видео-курс сканирующей конфокальной микроскопии и Microendoscopy

В данном видео демонстрируется способ сборки сканирующего конфокального микроскопа с видеочастотой сканирования с использованием стандартных готовых компонентов. Работа сканирующего конфокального микроскопа основана на скоординированном движении двух сканирующих зеркал для перемещения луча по растровой плоскости: свет от первого зеркала сканируется по горизонтали через первый набор релейных линз, которые фокусируют его обратно в неподвижную точку на втором сканирующем зеркале. Затем это же сканирующее движение передается через сканирующую линзу и тубусную линзу, в результате чего расширенный световой пучок попадает на заднюю апертуру объектива.

Второе зеркало, скорость движения которого невелика по сравнению с первым, одновременно сканирует ось Y, что позволяет осуществлять сканирование выше и ниже иллюстрированной плоскости, создавая прямоугольный растр на поверхности образца. Основным преимуществом данного протокола перед покупкой коммерчески доступного микроскопа является низкая стоимость и возможность адаптировать прибор под конкретные нужды проекта по визуализации. При работе с любым лазером крайне важно соблюдать соответствующие меры безопасности для предотвращения повреждения глаз.

По мере возможности обязательно используйте соответствующие защитные очки для работы с лазером. Зрители и исследователи, которые не занимаются непосредственно юстировкой или работой с лучом, должны всегда носить очки. Снимите все блестящие и отражающие часы или украшения.

Самое главное — постоянно следить за лучом и контролировать его, перекрывая его путь с помощью светового стопора или закрепленной визитной карточки. Это особенно важно при юстировке зеркал, так как траектория луча может быть труднопредсказуемой. Кроме того, никогда не держите глаза на уровне траектории луча.

Выключите лазер, если вам потребуется пересечь плоскость луча перед сборкой микроскопа. Убедитесь в наличии всего оборудования, необходимого для сборки, включая оптическую плиту и кронштейны под углом 90 градусов, все зеркала, линзы и дихроичный фильтр, а также соответствующие зажимы и крепежные детали, оба сканирующих зеркала и фотодетектор. Также будет полезно иметь под рукой генератор функций для проверки работы сканирования и управления зеркалами во время юстировки.

Также настоятельно рекомендуется закрепить оптический стол болтами для обеспечения устойчивости. Начните сборку микроскопа, поместив волоконный адаптер с «хвостиком» в оптический держатель, а затем установив этот узел в центре оптического стола. Это соответствует источнику синего луча, как показано здесь.

Включите источник света. С помощью регулировочных винтов грубо настройте луч так, чтобы он распространялся по прямой линии как в горизонтальном, так и в вертикальном направлении. Поместите ирисовую диафрагму перед коллиматором волокна.

Затем отрегулируйте высоту ирисовой диафрагмы так, чтобы луч проходил через ее центр. После этого переместите диафрагму дальше от атома вдоль пути прохождения луча. Проверьте юстировку луча.

При необходимости используйте два регулировочных винта, чтобы переместить луч относительно диафрагмы. Поместите установленное зеркало diic на пути луча так, чтобы лазерный луч был направлен в центр зеркала. Поверните держатель зеркала, чтобы отразить луч примерно под углом 90 градусов, следя за тем, чтобы высота луча оставалась неизменной.

Закрепите зеркало на столе, затянув винты на держателе. Затем поместите установленное резонансное гальванометрическое зеркало на путь лазерного луча. Убедитесь, что лазерный луч проходит точно по горизонтальному центру поверхности зеркала.

Поверните крепление зеркала так, чтобы лазерный луч отражался под углом 90 градусов. Затем грубо отрегулируйте отражение от зеркала, чтобы сохранить ту же вертикальную высоту лазерного луча. Далее возьмите две диафрагмы и поместите их непосредственно перед резонансным гальванометром.

Затем, используя лазерный луч, отраженный от резонансного гальванометрического зеркала, в качестве ориентира, установите их вертикальную высоту, как и прежде. Теперь, используя отверстия для винтов на оптическом столе в качестве визуального ориентира, закрепите две диафрагмы по одной прямой. Отрегулируйте первое зеркало в тракте (дихроичное зеркало), чтобы центрировать луч на первой диафрагме.

Затем отрегулируйте второе зеркало в тракте. Резонансный гальванометр должен центрировать луч на второй диафрагме. Итеративно настраивайте эти два зеркала до тех пор, пока луч не будет выровнен по обеим диафрагмам.

Убедитесь, что лазерный луч, отраженный от резонансного гальванометрического зеркала, по-прежнему отражается от центральной части зеркала. Если луч отклонен, отрегулируйте крепление коллиматора волокна и повторите настройку так, чтобы луч был центрирован относительно обеих открытых диафрагм. Следующим шагом является установка двух релейных линз, которые будут переносить изображение из первой стационарной телецентрической плоскости во вторую стационарную телецентрическую плоскость.

Для данного микроскопа выбранные линзы в первом реле имеют одинаковое фокусное расстояние F, поэтому расстояние между двумя зеркалами здесь составляет ровно четыре F. В данной установке F равно 90 мм, следовательно, позиция четыре F будет находиться на расстоянии 360 мм от сканирующего зеркала. Чтобы убедиться, что линзы расположены точно по центру пути луча, поместите первую линзу на пути луча и посмотрите на пятно лазерного луча на следующей диафрагме в тракте. После установки линзы отрегулируйте ее высоту так, чтобы вертикальный центр луча совпадал с центром диафрагмы.

Затем отрегулируйте положение горизонтального луча, чтобы центрировать его относительно диафрагмы. Повторите эту процедуру для второй линзы. Далее будет выполнена настройка сканирующего зеркала, и микроскоп будет повернут, чтобы облегчить прямое размещение и выравнивание деталей, которые в противном случае потребовали бы вертикальной регулировки.

Чтобы определить точное положение второй телецентрической плоскости, подключите резонансный гальванометр к сканирующему устройству и включите его. Используйте визитную карточку, чтобы проследить путь сканирующего луча через две линзы. Вторая телецентрическая плоскость будет находиться примерно на расстоянии 4F от резонансного гальванометра; она определяется как точка, в которой сканирующий луч кажется неподвижным.

Отметьте карандашом на оптическом столе точку под этим местоположением. После определения телецентрической плоскости установите входное напряжение сканирующего зеркала на 0 V и подайте питание на устройство управления зеркалом, чтобы зеркало перешло в нейтральное положение. Затем установите стандартное сканирующее гальванометрическое зеркало точно в положение телецентрической плоскости.

Отрегулируйте положение зеркала так, чтобы луч в телефокальной плоскости попадал точно в центр сканирующего зеркала, и затяните крепление зеркала. Затем ослабьте стопорный винт, удерживающий гальваносканирующее зеркало, и поверните его, чтобы убедиться, что луч распространяется вертикально. После этого выключите лазер и электронику сканирования.

Отсоедините волокно и отсоедините сканирующие зеркала. Затем, используя монтажные кронштейны для оптического стола под углом 90 градусов, закрепите второй оптический стол на первом.

Наконец, осторожно поверните весь микроскоп так, чтобы новая оптическая плита располагалась горизонтально, и с помощью зажима зафиксируйте микроскоп в этом положении. Снова подключите гальванометры и лазер, и не забудьте вернуть напряжение на гальванометре O до 0 V. Остальные этапы настройки, которая ранее выполнялась в вертикальном положении, можно легко реализовать на плоской оптической плите.

Далее мы установим второй набор релейных линз, официально называемых сканирующей и тубусной линзами. Пожалуйста, ознакомьтесь с прилагаемым письменным протоколом, чтобы получить важную информацию о выборе подходящей комбинации линз. Начните с установки линз.

Сначала расположите зеркала, необходимые для направления луча к объективу. Поместите первое большое двухдюймовое зеркало близко к краю оптического стола и поверните держатель зеркала так, чтобы лазерный луч отразился примерно на 90 градусов. Отрегулируйте отражение от зеркала, чтобы сохранить прежнюю высоту луча по вертикали.

Затем поместите второе двухдюймовое зеркало на противоположный край оптического стола, чтобы направить луч под углом 90 градусов, и зафиксируйте его с помощью регулировочных винтов. Далее установите две диафрагмы и, как и прежде, отрегулируйте два зеркала для центровки луча. Затем поместите сканирующую линзу на расстоянии ее фокусного расстояния от гальваносканера на пути луча и отрегулируйте ее положение по горизонтали и вертикали.

Чтобы центрировать лазерное пятно на первой диафрагме между двумя зеркалами, осторожно установите большую двухдюймовую тубусную линзу на соответствующем расстоянии от сканирующей линзы и отрегулируйте ее горизонтальное и вертикальное положение, чтобы центрировать луч на первой диафрагме. В данной установке тубусная линза при всех установленных компонентах располагается на расстоянии 75 миллиметров плюс 300 миллиметров.

Подключите gal O к выходу стандартного электрического генератора функций или схемы управления и установите размах напряжения от 1 до 3 вольт. Затем начните сканирование двумя зеркалами, используя визитную карточку. Найдите лазерный луч в неподвижной плоскости, на расстоянии 300 миллиметров после тубусного объектива.

Поместите объектив в тракт луча, стараясь расположить заднюю апертуру объектива как можно ближе к неподвижной плоскости. Установите предметный столик, убедившись, что крепление с перемещаемой осью Z не задевает крепление объектива при перемещении по всему диапазону. Для настройки конфокального отверстия и детектора сначала отключите все источники питания и оптоволокно.

Поверните узел микроскопа так, чтобы он снова опирался на оптический стол, удерживая резонансное сканирующее зеркало. После повторного подключения волокна к коллиматору и стандартному сканирующему зеркалу, а также кабелей питания, подачи и управления, подайте нулевое напряжение на управляющий выход стандартного сканирующего гальванометрического зеркала, как и ранее на предметном столике; поместите образец с ярким красителем между двумя покровными стеклами. Затем включите лазерный источник и сфокусируйтесь на красителе.

С помощью визитной карточки отрегулируйте мощность лазера так, чтобы флуоресценция была максимально яркой. Проследите путь флуоресцентного излучения от образца через объектив и систему сканирования к дихроичному зеркалу, которое отражает лазерный луч и пропускает флуоресцентное излучение. Найдите этот флуоресцентный сигнал с другой стороны дихроичного зеркала.

Теперь приглушите свет в помещении. Поместите зеркало за дихроичное зеркало, чтобы отразить излучение под углом 90 градусов. Затем, используя диафрагму с зеркалом, направьте луч флуоресценции максимально прямо и параллельно оптической плите.

Затем будет настроен блок конфикальной диафрагмы с использованием узла крепления пространственного фильтра в клетке от Thor Labs. На данной схеме представлена конфигурация установки. Сканирующее зеркало расположено в неподвижных плоскостях, находящихся в телецентрической позиции относительно неподвижного объектива.

Пары линз между неподвижными плоскостями в плоскости задней апертуры служат для ретрансляции сканирующих лучей. Первая пара линз имеет равное фокусное расстояние, образуя телескоп с коэффициентом увеличения один к одному. Вторая пара линз, официально именуемая сканирующей линзой и тубус-линзой, не обязательно должна иметь равное фокусное расстояние и зачастую выполняет функцию расширяющего телескопа для обеспечения переполнения задней апертуры объектива.

Свет, излучаемый образцом, проходит обратно через сканирующую систему и дихроичное зеркало. Линза с коротким фокусом или объектив фокусирует излучаемый свет через конфокальное отверстие, после чего он коллимируется линзой. Финальная линза фокусирует отфильтрованное конфокальное излучение на фотоумножитель.

Разместите блок пространственного фильтра на пути пучка излучения, стараясь центрировать оправу первой фокусирующей линзы относительно пучка. В данном случае был выбран блок пространственного фильтра с отверстием диафрагмы 100 мкм. Затем установите в блок линзу с коротким фокусным расстоянием и перемещайте Z-трансляционный механизм до тех пор, пока на поверхности диафрагмы не будет наблюдаться четкий фокус.

Убедитесь, что весь блок ориентирован вдоль прямой линии, задаваемой флуоресцентным лучом. Закрепите блок на оптическом столе. Теперь с помощью регулировочных ручек на предметном столике настройте обе оси для проведения двумерного поиска по поверхности крепления диафрагмы, чтобы найти точку, в которой сигнал флуоресценции через диафрагму будет максимальным.

Затем с помощью визитной карточки установите фильтр на держатель в клетке после диафрагмы (pinhole), найдите флуоресцентный сигнал, проходящий через конфокальный блок, и перемещайте фильтр вдоль направляющих до максимально возможной коллимации излучаемой флуоресценции. Подготовьте узел фотоэлектронного умножителя. Поместите линзу с фокусным расстоянием 50 миллиметров в путь пучка флуоресцентного излучения и определите ее фокус.

Отметьте это положение на макетной плате. Теперь полностью выключите лазер и установите фотоэлектронный умножитель так, чтобы его окно находилось как можно ближе к отмеченной фокальной точке. Затем с помощью регулируемых линзовых трубок соедините этот узел с фокусирующей линзой.

Оберните темной изолентой все открытые пути прохождения луча после стенового отверстия, затем включите лазер, поддерживая его мощность на крайне низком уровне. Включите фотоэлектронный умножитель, внимательно отслеживая его напряжение на экране осциллографа. По мере увеличения интенсивности лазера повышайте напряжение до тех пор, пока на экране осциллографа не появится сигнал в виде всплеска и/или постоянное смещение.

Подтвердите, что данный сигнал действительно вызван флуоресценцией, выключив лазер или перекрыв путь луча, чтобы зафиксировать исчезновение сигнала. Наконец, итеративно настройте положение диафрагмы (пинхола) для достижения максимального сигнала на осциллографе. После первоначального изменения положения фокусирующей линзы по оси Z и последующей регулировки стейджа перемещения по осям YZ сборка оборудования микроскопа для видеосъемки будет завершена.

Сначала выключите фотоэлектронный умножитель. Теперь подключите платы управления зеркалами и компьютер согласно схеме, приведенной в прилагаемом письменном протоколе. Данная система может быть адаптирована для проведения конфокальной сканирующей микроэндоскопии.

Для замены предметного столика на держатель оптического волокна ознакомьтесь с сопровождающим текстом или подробным описанием. Готовый вертикальный конфокальный сканирующий микроскоп и микроэндоскоп должны выглядеть так, как показано здесь. Лучи лазера и эмиссионные лучи нарисованы для наглядности.

В ходе микроэндоскопической операции фиберный держатель фиксирует оптическое волокно для проведения экспериментов. Для определенных целей этот держатель можно легко заменить на XY-платформу. Представленная здесь платформа вертикального микроскопа является репрезентативным тестовым изображением строчной буквы «M», напечатанной на белой визитной карточке; изображения были получены из входящего сигнала с помощью платы захвата кадров с видеочастотой. Обесцвечено.

Белая бумага содержит флуорофоры, которые легко возбуждаются УФ- и синим светом, что создает яркий фон за темными объектами. Для сбора этого флуоресцентного излучения был выбран фильтр эмиссии с центром на 515 нанометрах. Можно заметить небольшое искажение изображения, особенно вблизи боковых краев кадра.

Это искажение возникает из-за синусоидальной схемы сканирования gvo-зеркала с частотой 8 кГц и подробно обсуждается в сопроводительном документе. В данном видео представлены примеры данных, полученных при сканировании визитной карточки со скоростью видеопотока. После просмотра этого видео у вас должно сложиться четкое представление о том, как собрать и юстировать конфокальный сканирующий микроскоп, работающий в режиме видеоскорости.

Не забывайте, что работа с лазерным излучением может быть чрезвычайно опасной, поэтому при выполнении данной процедуры следует всегда соблюдать меры предосторожности, такие как снятие всех reflective украшений и недопущение нахождения глаз на одном уровне с линией луча.