Физиологические Эксперименты с раков кишке: Упражнение Студенческая лаборатория

Общая цель данного отчета заключается в том, чтобы служить учебным пособием для учащихся старших классов и студентов бакалавриата, изучающих физиологию и участвующих в физиологических экспериментах. Студенты учатся обнажать и регистрировать сокращения задней кишки речного рака. Следующим этапом является иссечение задней кишки из организма животного, что позволяет осуществлять прямое нанесение соединений.

Затем регистрируются сила и ритм сокращений гладких мышц задней кишки при воздействии различных фармакологических агентов для изучения механизмов, изменяющих силу сокращения. На основании фармакологических анализов и определения подтипов рецепторов получаются результаты, демонстрирующие действие модуляторов на нервные окончания или непосредственно на мышцы. Здравствуйте, я доктор Дж. Мерсье с кафедры биологических наук Университета Брока.

Я использую препарат задней кишки речного рака для проведения исследований нейромедиаторов, которые контролируют висцеральные мышцы. Также я использую этот препарат в качестве учебного пособия; в рамках сотрудничества с лабораторией доктора Робина Купера из Университета Кентукки мы совершенствуем ряд экспериментов, выполняемых студентами в учебных целях. Данный метод позволяет получить представление о функциях задней кишки речного рака.

Данный метод также может быть применен в исследованиях заболеваний, в том числе связанных с нарушением перистальтических ритмов. Кроме того, он может использоваться для описания механизмов, лежащих в основе модуляции мышечной и нервной иннервации. Студенты научатся интерпретировать физиологические и фармакологические данные с помощью фармакологических агентов, нейромедиаторов и нейрогормонов, а также получат общее представление о функционировании рецепторов.

Что касается агонистов и антагонистов, студенты должны построить кривые «доза-эффект» и представить данные в графическом виде для статистического анализа. Для анестезии животного поместите речного рака длиной тела от 6 до 10 сантиметров на лед на 5–10 минут. Удерживая анестезированного рака одной рукой за спиной клешней, быстро сделайте надрезы от глазниц до середины головы с обеих сторон, после чего обезглавьте рака.

Кровь из препарата станет липкой при высыхании, поэтому по завершении работы промойте инструменты. Затем отрежьте конечности и клешни. После этого удалите левый и правый хвостовые плавники, оставив средний хвостовой плавник; сделайте разрез вдоль дорсальной стороны брюшка до последнего сегмента.

Затем сделайте разрез вдоль последнего сегмента и вниз по другой стороне. Снимите спинной панцирь. Поместите препарированного рака в чашку Петри, выстланную салфеткой.

Раствор для регенерации тканей речного рака. Чтобы зафиксировать препарат, используйте энтомологические булавки, прикрепив его к чашке Петри. Задняя кишка обычно окружена скоплением кровеносных сосудов и соединительной ткани.

Удалите их с помощью пинцета, стараясь не повредить кишечник. Теперь вдоль брюшка видна задняя кишка.

Оставьте препарированный кишечник речного рака в физиологическом растворе примерно на 10 минут, чтобы препарат восстановился после шока, вызванного диссекцией и воздействием раствора. Дождитесь появления медленных перистальтических сокращений задней кишки. Теперь можно приступить к расчету частоты сокращений.

Подсчитайте количество сокращений, произошедших за 30 секунд, и занесите данные в журнал. Также зафиксируйте тип сокращений, указав, являются ли они перистальтическими или спастическими. Отметьте направление любых перистальтических волн.

Подсчитайте частоту сокращений в области вблизи анального отверстия и в средней части брюшка, чтобы определить, есть ли различия в частоте между этими двумя областями. Подготовьте набор тестовых растворов, температура которых должна соответствовать температуре физиологического раствора для купания. Первым испытуемым раствором будет 1 µM серотонина, приготовленный на физиологическом растворе для раков.

С помощью пипетки удалите физиологический раствор из полости открытого брюшка речного рака и нанесите раствор серотонина в концентрации 1 µM непосредственно на заднюю кишку. Сразу после добавления нового раствора подождите 30 секунд, затем подсчитайте количество сокращений в области анального отверстия за 30 секунд, а затем подсчитайте количество сокращений за следующие 30 секунд в средней части брюшка. Запишите эти значения в таблицу, а также отметьте тип наблюдаемых сокращений.Далее.

Слейте тестовый раствор из чашки для регистрации и несколько раз промойте заднюю кишку обычным физиологическим раствором для раков. Затем промывайте препарат каждые 30 секунд в течение пяти минут. После этого можно добавить следующий тестовый раствор, который в данной демонстрации представляет собой 1 µM топамина.

Записывайте результаты наблюдений, как и прежде, и повторите этот процесс для остальных исследуемых соединений. При использовании нескольких концентраций одного и того же вещества обязательно начинайте с самой низкой концентрации и переходите к более высоким. Установка для измерения силы сокращений ЖКТ включает в себя ноутбук с программным обеспечением LabChart 7, Bridge Pod, PowerLab 26T и датчик силы.

Прежде чем приступить к измерению силы сокращений мышц ЖКТ, необходимо изолировать желудочно-кишечный тракт. Для этого удалите мышцы в последнем сегменте брюшка, закрепите две или более булавки через мягкую вентральную кутикулу по обе стороны от анального отверстия, затем удалите остальную часть брюшка, оставив заднюю кишку и анальное отверстие прикрепленными к небольшому фрагменту кутикулы. Кишку следует отсечь близко к месту соединения груди и брюшка.

Теперь перенесите ЖКТ в неглубокую чашку с дном, покрытым сардиновой оболочкой. Вдоль дорсальной стороны ЖКТ проходит кровеносный сосуд. Осторожно отделите его от ЖКТ.

Залейте препарат свежим физиологическим раствором для раков. Переместите датчик силы над препаратом. Внимательно осмотрите штифт, приклеенный к нижней части датчика силы.

Конец, который крепится к кишечнику, имеет небольшой изгиб. Зацепите этот изгиб булавкой за срезанный конец задней кишки. После закрепления задней кишки слегка переместите чашку, пока кишечник не натянется.

Будьте осторожны на этом этапе, так как кишечник должен быть натянут, но не слишком сильно. Чрезмерное натяжение может привести к повреждению мышц. Когда чашка будет находиться в оптимальном положении, используйте воск или глину, чтобы зафиксировать ее.

Затем запустите программное обеспечение. Для начала записи откройте программу LabChart. Закройте приветственный центр LabChart.

Перейдите в раздел «Настройки» (setup) в верхнем левом углу. Нажмите на «Настройки каналов» (channel settings) в нижнем левом углу. Измените настройки каналов так, чтобы был активен только один канал.

Нажмите «ОК» в правой части экрана. Перейдите к каналу 1 («channel one») и откройте окно мостовой схемы («bridge pod»). В верхней правой части диаграммы установите диапазон на наиболее чувствительное значение, в данном случае 200 microvolts.

Установите частоту циклов на 2K. Теперь вы готовы к записи. Нажмите «старт», чтобы убедиться в правильности работы установки.

Слегка коснитесь кончика преобразователя пипеткой. Вы должны увидеть изменение силы, регистрируемое программным обеспечением. Нажмите «stop» в программе, затем нажмите «start» и запустите выполнение программы.

Примерно через 20 секунд нажмите кнопку остановки и добавьте комментарий с пометкой «физраствор». Рассчитайте частоту сокращений, измеряя время от начала одного отклонения до начала следующего или подсчитав общее количество отклонений за одну или две минуты. Рассчитайте частоту в сокращениях в минуту или в сокращениях в секунду, в зависимости от их интенсивности.

Для измерения силы сокращений используйте относительный показатель, чтобы сравнить сокращения при различных условиях в сохраненном файле. Переместите маркер M на базовую линию, затем переместите курсор на пик отклонения и запишите значение, указанное в правом верхнем углу экрана. Это дельта-значение, представляющее собой разницу между точкой M и пиком.

Обратите внимание, что для измерения изменения курсор должен оставаться неподвижным на пике. Затем переместите маркер M и курсор к следующей интересующей форме волны и повторите измерение, чтобы изучить эффект модуляторов. В данной подготовке медленно замените физиологический раствор на тестовый раствор.

В данном случае введите один микромоляр serotonin и продолжите запись частоты и силы сокращений в качестве последнего теста. Для данного препарата проверьте, изменяют ли ингибиторы щелевых контактов частоту или силу сокращений; к ингибиторам щелевых контактов относятся one hep ethanol или физиологический раствор, насыщенный carbon dioxide. Эти соединения используются в последнюю очередь, так как при длительном воздействии они могут повредить мышечные волокна. Для сравнения эффектов различных соединений постройте график по полученным данным.

Еще одним интересным применением данной подготовки является регистрация силы, создаваемой кольцевыми мышцами. Однако, если вы применяли к подготовке ингибиторы щелевых контактов, они могли повредить кольцевые мышцы; в таком случае для тестирования кольцевых мышц следует использовать свежую подготовку задней кишки. Чтобы обнажить кольцевые мышцы, сделайте продольный разрез трубки кишки тонкими ножницами.

С помощью тонких булавок надежно закрепите один конец полоски к чашке. Прикрепите крючок датчика к другому концу полоски. Воздействуйте на препарат теми же соединениями, которые тестировались на продольных мышцах; зависимость между протестированными соединениями, количеством и типом сокращений показана здесь.

Вы можете построить график зависимости количества сокращений от времени для растворов физиологического раствора, серотонина и глутамата. Вы также можете построить график зависимости количества сокращений от силы сокращений в милливольтах для растворов физиологического раствора, серотонина и глутамата. Эти графики можно составить как для продольных, так и для кольцевых мышц, чтобы проверить, проявляют ли продольные и кольцевые мышцы в различных отделах кишечника разную реакцию на воздействие различных модуляторов.

Приведенные выше эксперименты можно повторить на различных участках, начиная от анального отверстия и поднимаясь вдоль брюшной стенки. При выполнении данной процедуры важно помнить о необходимости соблюдать осторожность, чтобы не повредить ЖКТ пинцетом и не прилагать слишком большое усилие при использовании датчика силы. После выполнения данной процедуры могут быть применены другие методы, такие как электрофизиологическая регистрация активности мышц, для изучения других вопросов, например, функций и модуляции ионных каналов, что может служить моделью для исследования других тканей у других видов животных.