Мембранные потенциалы, Synaptic Ответы, нейронной цепи, Нейромодуляция и мышцы гистологии Использование раков: Упражнения Студенческая лаборатория

Общие цели следующих экспериментов заключаются в изучении свойств возбудимых мембран и ионной основы потенциала покоя мембраны, освоении методов измерения мембранного потенциала, а также в демонстрации свойств синаптической передачи. В одной части эксперимента будет проведен замер потенциала покоя мембраны при изменении концентрации внеклеточного калия. В другой части эксперимента будут исследованы механизмы синаптической дифференциации путем регистрации стимулированных синаптических ответов в различных двигательных единицах.

Далее представлена нейронная цепь, которая легко поддерживается в жизнеспособном состоянии. Данный препарат может быть использован как в учебных целях, так и для исследования различных аспектов цепи «сенсорный нейрон — ЦНС — мотонейрон — мышца». Этот комплекс экспериментов демонстрирует простоту использования модели речного рака для изучения вопросов, касающихся мембранного потенциала, синаптической интеграции и передачи сигналов, а также структурных различий типов мышечных волокон.

Основными преимуществами использования препарата из речного рака при изучении электрофизиологических концепций и методов являются простота диссекции, жизнеспособность препарата в минимальном объеме физиологического раствора, легкость получения синаптических ответов и наглядность общего анатомического расположения мышц. Эти методы могут быть применены и к другим препаратам, что позволит углубить понимание синаптической физиологии и модуляции, а также биохимических и структурных особенностей исследуемого препарата. Чтобы приступить к операции, выберите рака длиной тела примерно от 6 до 10 см и поместите его в дробленый лед на пять минут для анестезии. Для декапитации рака удерживайте его за затылочную часть головы, используя большие ножницы и следя за тем, чтобы пальцы находились вне зоны досягаемости клешней и рта рака.

Быстро отсеките голову, сделав чистый разрез позади глаз рака, удалите ноги и клешни, чтобы избежать травм. Удалите стили у самцов и плеоподы у самцов и самок. Утилизируйте голову и придатки.

Затем отделите брюшко от головогруди, сделав разрез по сочленяющей мембране, соединяющей брюшко и головогрудь. Сохраните брюшную часть рака, а головогрудь удалите. Направив ножницы слегка вниз к вентральной стороне и под углом, сделайте разрез панциря вдоль нижней латеральной границы каждой стороны брюшка. Будьте осторожны, чтобы не прорезать ткани рака слишком глубоко.

С помощью пинцета следуйте вдоль естественных линий панциря река, проходящих по всей длине каждого сегмента. Удалите вентральную часть панциря, потянув ее вверх и назад, стараясь не повредить мышцы брюшка.

Удалите мышцы-сгибатели. На данном этапе над глубокими мышцами-сгибателями видна белая масса ткани. Осторожно удалите эту ткань с помощью пинцета.

ЖКТ теперь виден как небольшая трубка, проходящая вдоль срединной линии глубоких сгибателей. Удалите его, зажав пинцетом в верхней части и оттянув от брюшной полости. Отрежьте нижний конец ЖКТ у основания хвоста.

Промойте область диссекции физиологическим раствором, чтобы остатки фекалий не мешали подготовке препарата. С помощью диссекционных булавок закрепите верхние и нижние углы препарата на чашке Петри с покрытием S guard. Теперь абдоминальные мышцы-разгибатели открыты.

Налейте физиологический раствор в чашку Петри так, чтобы препарат был полностью покрыт до начала проведения внутриклеточных записей. Переместите чашку Петри под микроскоп и зафиксируйте ее с помощью воска, чтобы предотвратить смещение. Аппарат, используемый для проведения внутриклеточных записей, показан на данном рисунке.

Соответствующие соединения и настройки приведены в сопровождающем тексте. Настройте программное обеспечение для лабораторных диаграмм согласно инструкциям. В соответствии с сопровождающим текстом поместите заземляющий провод в солевой раствор.

Поместите кончик стеклянной микропипетки, заполненной 3 M раствором хлорида калия, в физиологический раствор и проверьте сопротивление электрода. Сопротивление электрода должно составлять от 20 до 60 МОм. Используйте грубый регулятор усилителя, чтобы при интенсивном освещении совместить линию на графике с нулевой отметкой.

Посмотрите в микроскоп и найдите продольные мышцы DEM. С помощью электродного зонда введите внутриклеточный электрод в мышечное волокно мышцы DEM. Электрод должен быть введен в мышечное волокно лишь слегка.

Будьте осторожны, чтобы не проткнуть клетку насквозь. Измерьте амплитуду потенциала покоя. Перетащите курсор M на кривую из нижнего левого угла окна графика.

Поместите маркер M на базовую линию и переместите курсор в самую низкую точку зарегистрированного сигнала. Разница между маркером и активным курсором отображается в верхней правой части экрана. Это значение представляет собой напряжение потенциала покоя мембраны.

Разделите зарегистрированное напряжение на коэффициент усиления; в данном случае использовалось усиление 10x. Затем переведите значение напряжения из вольт в милливольты. После регистрации потенциала покоя данного мышечного волокна посмотрите в микроскоп и осторожно извлеките электрод из волокна.

Повторите внутриклеточную регистрацию на других мышечных волокнах. В следующей части этого эксперимента будет изучено влияние повышения внеклеточной концентрации калия на потенциал покоя мембраны. Будут использованы шесть растворов физиологического раствора для речного рака с концентрациями калия 5,4, 20, 40, 60, 80 и 100 мМ.

Для следующей внутриклеточной регистрации выберите мышцу, которая не сокращается. Замените раствор в ванночке раствором хлорида калия следующей более высокой концентрации. При этом каждый раз следите за тем, чтобы препарат был полностью погружен в раствор.

Зафиксируйте изменения мембранного потенциала для каждого раствора. Эффект повышения внеклеточной концентрации калия на мембранный потенциал показан на данном скриншоте; постройте график зависимостей потенциалов покоя для каждой концентрации калия на полулогарифмическом графике зависимости мембранного потенциала от внеклеточной концентрации калия. Сопоставьте потенциал покоя при внеклеточной концентрации калия 5.4 millimolar.

Для гипотетической и наблюдаемой кривых сравните наклон наблюдаемой линии с наклоном гипотетической линии. После завершения этих электрофизиологических записей следующим шагом будет изучение анатомии мышечных волокон и схемы их иннервации. Перенесите препарат в чашку Петри и добавьте метиленовый синий.

Через пять минут удалите метиленовый синий и добавьте свежий физиологический раствор для раков. Найдите главный нерв, иннервирующий мышцы внутри сегмента. Зарисуйте схему иннервации мышц S-E-M-D-E-L 2D EL one и DEM в сегменте.

Далее переместите препарат под вытяжной шкаф. Удалите физраствор и добавьте фиксатор. В данном случае в качестве фиксатора используется раствор пойна.

Вытяжной шкаф используется для защиты от паров фиксатора. Будьте предельно осторожны, чтобы раствор не попал на кожу или в глаза. При возникновении чувства жжения в глазах немедленно промойте их на станции для промывки глаз.

Оставьте раствор боина на препарате примерно на 10 минут, затем с помощью пипетки замените раствор физиологическим раствором. Вырежьте тонкий сегмент мышцы DEL one или DEL two. Поместите его на предметное стекло.

Промаркируйте предметное стекло. Повторите процедуру для мышцы SEM. Используя световой микроскоп, изучите структуру поперечного исчерчивания саркомеров в обоих препаратах тканей.

В следующей серии экспериментов будет изучен способ регистрации синаптических ответов в брюшных мышцах речного рака. Выберите другого рака и проведите декапитацию. Удалите грудной отдел и конечности, чтобы обнажить мышцы-разгибатели брюшка, как показано в ходе хирургической операции.

В первой части этого видео с помощью микроскопа найдите нерв, по которому моторные аксоны идут к мышцам-разгибателям. Выберите сегмент с наиболее доступным нервом. Нерв имеет белый цвет; чтобы его увидеть, можно сбрызнуть препарат физиологическим раствором из пипетки или слегка подуть на него.

Это заставляет нерв смещаться, что облегчает его идентификацию. С помощью микроманипулятора поместите всасывающий электрод непосредственно над нервом. Осторожно потяните за шприц, чтобы втянуть нерв в электрод.

Через микроскоп можно наблюдать, как нерв втягивается в электрод. Настройте параметры в программном обеспечении для лабораторных диаграмм в соответствии с указаниями в сопроводительной статье. Заполните стеклянный микроэлектрод 3 M раствором хлорида калия, после чего подключите его к головному блоку и системе PowerLab.

Используйте ручку грубой настройки усилителя, чтобы совместить линию на лабораторном графике с нулем. Перед установкой электрода переключатель следует несколько раз включить и выключить. Для проверки сопротивления электрода измерьте амплитуду полученных значений.

Смотрите в микроскоп и с помощью электродного зонда введите электрод в одно из продольных мышечных волокон: либо в DEM, либо в DL1 или DL2. Будьте осторожны, чтобы не проткнуть мышечное волокно насквозь. Теперь препарат готов к эксперименту.

Вакуумный электрод используется для стимуляции сегментарного нервного пучка, а стеклянный микроэлектрод — для регистрации синаптического ответа мышечного волокна; запустите стимулятор для стимуляции нерва с частотой 1 Hz для получения фазических ответов. Затем поместите электрод в волокно мышцы SEL. SEL представляет собой тоническую мышцу.

Стимулируйте нерв короткими пачками импульсов с частотой 10 hertz для получения тонических ответов. Сравните зарегистрированные ответы мышц DEL и SEL. Обратите внимание, что фазические мышцы DEL демонстрируют синаптические ответы с большей амплитудой, чем тонические мышцы SEL.

Следующая серия экспериментов сосредоточена на мышцах-сгибателях хвоста рака, а не на мышцах-разгибателях. Используя нового рака, изолируйте брюшко, как показано в данной хирургической процедуре. В первой части этого видео поместите изолированный препарат хвоста в чашку Петри с физиологическим раствором, зафиксируйте хвост и верхнюю часть препарата булавками.

Обратите внимание, что при проведении экспериментов по декаронализации тонических мышц-сгибателей вентральный нервный шнур должен оставаться неповрежденным. С помощью скальпеля сделайте продольный разрез через сочленяющую мембрану между двумя ребрами на вентральной стороне препарата. Будьте очень осторожны и не делайте слишком глубокий разрез, так как глубокий разрез может привести к пересечению двигательного корешка нерва; убедитесь, что поверхностные мышцы не повреждены.

Перейдите к следующему шагу. Глядя в микроскоп, с помощью ножниц или скальпеля сделайте горизонтальный разрез от продольного разреза в тонком слое мембраны, покрывающей мышцу. Расширьте разрез, чтобы сформировать лоскут суставной мембраны, и приподнимите этот лоскут вверх.

С помощью ножниц отсеките кожный лоскут, чтобы обнажить поверхностные мышцы-сгибатели для проведения внутриклеточной регистрации из этих мышц. Используйте тот же инструментарий и установку, которые применялись для регистрации потенциала покоя и синаптических ответов мышц-разгибателей брюшного отдела. Как и ранее, используйте внутриклеточный электрод, заполненный 3 M раствором хлорида калия.

Введите электрод в мышечное волокно поверхностных мышц-сгибателей, стараясь не проткнуть мышцу насквозь. Зарегистрируйте спонтанную активность ВПСП. Обратите внимание на различия в амплитуде ВПСП, а также на наличие каких-либо ТПСП.

Возьмите маленькую кисточку и осторожно проведите ею вдоль края кутикулы в том же сегменте, где находится регистрирующий электрод. Если наблюдается более выраженная реакция, отметьте любые изменения частоты или амплитуды EPSP, вызванные стимуляцией. Это будет указывать на рекрутирование дополнительных двигательных нейронов, реагирующих на изменение активности сенсорного нерва.

Осторожно замените раствор солевого буфера на раствор, содержащий нейромодулятор, например 1 µM серотонина, или физраствор, насыщенный углекислым газом. Затем повторно проведите стимуляцию кисточкой. Отметьте, как изменение состава раствора в ванночке влияет на регистрируемую активность.

Замените солевой раствор в ванночке обратно на обычный физиологический раствор и убедитесь, что активность мышечного волокна вернулась к исходному уровню. На этом рисунке показаны ВПСП, зарегистрированные в поверхностном волокне мышцы-сгибателя. Обратите внимание на различную амплитуду ВПСП.

На следующем этапе этого эксперимента используется внеклеточный электрод для мониторинга потенциалов действия моторных нейронов, реагирующих на активность в цепи «сенсорный нейрон — ЦНС — моторный нейрон». Начните с изготовления вакуумного электрода для стимуляции сенсорных нервов. Вытяните фрагмент пластиковой трубки над пламенем.

Следующий шаг — обрезать трубку до нужного размера. Для этого необходимо осмотреть нерв в вашем препарате, чтобы определить подходящий диаметр отверстия для всасывающего электрода. В зависимости от размера рака диаметр нервных пучков может варьироваться примерно от одного миллиметра до нескольких миллиметров.

Обрежьте растянутый участок трубки так, чтобы отверстие в наконечнике имело правильный размер для фиксации нерва. Если отверстие будет слишком большим, нерв может выпасть. Если же отверстие будет слишком маленьким, давление электрода может повредить нерв.

Наденьте пластиковую трубку на кончик стеклянного всасывающего электрода. Настройка электрофизиологического оборудования и программного обеспечения для мониторинга внеклеточных ответов несколько отличается от настройки для внутриклеточных записей. Используя оборудование, указанное в сопроводительном описании, втяните третью ветвь нерва, иннервирующую поверхностную сгибательную мышцу, в всасывающий электрод.

Теперь можно приступить к записи потенциалов действия. Этот путь включает пять возбуждающих моторных нейронов и один тормозный моторный нейрон. После записи базовой активности стимулируйте кутикулу кисточкой, чтобы пронаблюдать изменение генерируемых потенциалов действия.

После этого замените раствор в ванночке нейромодуляторами, например серотонином, как в предыдущем эксперименте, и зафиксируйте любые изменения в ответе. Дополнительные задания приведены в сопроводительном тексте. На данной записи показаны потенциалы действия, зарегистрированные в третьем пути до и во время стимуляции кутикулы кисточкой; сравните частоту потенциалов действия до касания кисточкой и во время стимуляции.

На данной записи показаны потенциалы действия, зарегистрированные с третьего нервного пути в нормальном физрастворе и в растворе серотонина. Сравните частоту потенциалов действия в нормальном физрастворе с их частотой в присутствии серотонина, как показано выше. Механическое раздражение (кисточкой) увеличивает частоту разрядов относительно базового уровня.

Также было продемонстрировано, что серотонин увеличивает частоту разрядов по сравнению с нормальным физиологическим раствором. На этом рисунке показано, что при сочетании механического воздействия (поглаживания) и введения серотонина наблюдается еще более значительное увеличение частоты разрядов. Сравнение внешних и теоретически рассчитанных эффектов концентрации внешнего калия на потенциал покоя мембраны указывает на влияние ионов на мембранный потенциал.

Мы также продемонстрировали вам, как регистрировать ответы ntic в нервно-мышечных соединениях как фазических, так и тонических мышц. Эти методы могут быть использованы в рамках учебных лабораторных работ для изучения фундаментальных концепций и физиологии. Навыки, полученные в ходе данного лабораторного упражнения, могут быть применены для поиска ответов на вопросы, касающиеся других лабораторных препаратов, а также для решения физиологических задач, связанных с медициной и здравоохранением.