Постсинаптических Записи в Афферентные Дендриты Обращение Кохлеарные внутренние волосковые клетки: Мониторинг мультивезикулярные релиз на ленте Synapse

Общая цель данной процедуры — регистрация постсинаптической активности в афферентных синапсах внутренних волосковых клеток. Это достигается путем первоначального обнажения сенсорного эпителия улитки, недавно извлеченной из обезглавленной крысы. Вторым этапом процедуры является помещение иссеченного апикального завитка на модифицированное покровное стекло и его перенос в регистрирующую камеру.

Третьим этапом процедуры является поиск и получение доступа к афферентной аксоне с записывающим электродом. Заключительным этапом процедуры является создание плотного контакта с мембраной афферентного волокна с последующим ее разрывом для установления цельноклеточной конфигурации метода патч-клампа. В итоге можно получить результаты, демонстрирующие постсинаптические события или потенциалы одиночного лентовидного синапса с помощью цельноклеточной электрофизиологии методом патч-клампа.

Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение, так как препарирование и подготовка тканей улитки требуют длительного обучения, а мелкие афферентные волокна трудно распознать и получить к ним доступ. Перед началом препарирования подготовьте модифицированное покровное стекло, которое будет удерживать препарат на месте во время регистрации данных. Используя круглое стеклянное покровное стекло диаметром от 8 до 12 мм, нанесите каплю частично отвержденного Sylgard ближе к краю стекла.

Поместите толстый конец тонкой энтомологической булавки на покровное стекло. Плотно прижмите булавку к стеклу. С помощью пинцета нагрейте защитный бортик о нагретую спираль для фиксации.

Подготовьте от 10 до 20 микроэлектродов согласно описанию в сопроводительном тексте. После огневой полировки на микрокузнице внешний диаметр кончика микроэлектрода должен составлять примерно один микрон. После наркотизации и декапитации трехнедельной крысы окончательная толщина стенки пипетки составляет около одной трети микрометра.

Начните диссекцию с удаления кожи, затем проведите диссекцию головы и извлеките головной мозг. Для доступа к височной кости удалите обе височные кости. Поместите каждую височную кость в чистую чашку для диссекции со стандартным внеклеточным раствором. Следующим шагом является удаление костной ткани, окружающей височную кость, чтобы обнажить улитку.

Надежно зафиксируйте височную кость у основания с помощью пинцета. Найдите круглое и овальное окна, а также улитку. Расположите улитку так, чтобы овальное окно и спиралевидная сторона улитки были обращены вверх.

Удалите излишки костной ткани вокруг улитки. Используйте вторую пару тонких пинцетов, чтобы отсечь кость непосредственно от улитки, начиная с области, которая более прозрачна, чем остальная часть кости. В этом месте кость тоньше, и ее легче удалить.

Продолжайте удалять кость вокруг апикального витка. С помощью микродиссекционных ножниц перережьте модиолюс под апикальным витком. Затем отделите апикальный виток от нижних витков улитки.

Следите за тем, чтобы не повредить апикальный завиток. Его нельзя тянуть или растягивать. В завершение аккуратно извлеките апикальный завиток из улитки, стараясь максимально избежать разрывов ткани.

С помощью тонкого пинцета удалите оставшиеся части кости. Следующим шагом является удаление STR of oculis и tial мембраны. Осторожно удалите STR of oculis — блестящую полоску ткани, расположенную снаружи от области волосковых клеток.

Следите за тем, чтобы не удалить сенсорные волосковые клетки, которые могут легко отслоиться вместе с STR oculis. Затем с помощью тонкого пинцета отделите тиальную мембрану. Эта блестящая полупрозрачная мембрана располагается над сенсорными волосковыми клетками; теперь удалите излишки тканей и кости и расправьте препарат пинцетом.

Это необходимо для того, чтобы ткань можно было равномерно закрепить под булавкой. На этом препарирование закончено. Поместите препарат под булавку на подготовное покровное стекло, стараясь расположить булавку вдали от волосковых клеток после завершения препарирования.

С помощью пинцета перенесите препарат в регистрирующую камеру, сохраняя каплю внеклеточной жидкости на покровном стекле, на котором закреплена ткань улитки, после чего немедленно начните перфузию внеклеточным раствором. Для обеспечения лучшей выживаемости препарата используйте 10-кратный объектив микроскопа или 40-кратный DIC-объектив с иммерсией в воду. Чтобы найти препарат, ориентируйте его таким образом, чтобы регистрирующие электроды могли приблизиться к внутренним волосковым клеткам под прямым углом к их латеральным стенкам.

Если видимость базальной области внутренних волосковых клеток ограничена из-за того, что препарат скручен, используйте регистрирующий электрод, чтобы прижать внешний край препарата к стеклянному покровному стеклу. При этом будьте осторожны, чтобы не нажать на сами внутренние волосковые клетки. На данном препарате верхний электрод прижимает внешний край препарата, а нижний электрод отмечает место расположения афферентных батонов.

Для справки: камера NC 70 Nuv Con выводит увеличенное изображение Forex на монитор, чтобы оценить состояние тканей в области внутренних волосковых клеток. Используйте пучки стереоцилий в качестве ориентира и перемещайте фокус вниз для поиска ядер. Сместите фокус еще ниже, к основанию внутренних волосковых клеток с их афферентными окончаниями, а затем верните его вверх, пока на мониторе не будет достигнут уровень ядер.

Теперь найдите афферентные батоны вокруг основания внутренних волосковых клеток. Батоны имеют сферическую или эллипсоидную форму, их диаметр составляет примерно one micron; они светлого цвета с блестящей поверхностью. Вы сможете обнаружить их, перемещая фокус вверх и вниз.

Следующим шагом является расчистка пути к афферентным волокнам с помощью регистрирующего электрода с кончиком диаметром 1 µm, заполненного внутриклеточным раствором. Создайте положительное давление и с помощью микроманипулятора подведите электрод к препарату. Используйте этот электрод, чтобы сделать надрез в препарате на уровне основания внутренней волосковой клетки.

Проведите электрод между тонким слоем поддерживающих клеток и внутренними волосковыми клетками, используя положительное давление, чтобы создать путь доступа к области у основания внутренних волосковых клеток. Осторожно извлеките электрод и замените его новым электродом с диаметром кончика 1 мкм, заполненным внутриклеточным раствором. Используя положительное давление для поддержания чистоты кончика электрода, переместите регистрирующий электрод через отверстие доступа мимо соседних поддерживающих клеток по направлению к афферентной батонелле.

Убедитесь, что кончик электрода находится непосредственно перед афферентным окончанием; окончания оказывают большее сопротивление движению пипетки, чем поддерживающие клетки и мембрана внутренней волосковой клетки. Эту разницу можно почувствовать при перемещении пипетки; двигайте пипетку вверх-вниз и слегка надавите, чтобы убедиться, что окончание смещается. Это указывает на то, что кончик пипетки и окончание находятся в одной плоскости фокусировки, а электрод прижат к афферентному окончанию. Одновременно сбросьте положительное давление и создайте вакуум для формирования гигаомного контакта.

Примените кратковременное осторожное всасывание для разрыва мембраны внутри электрода, чтобы перейти в режим регистрации от всей клетки. Если патч-запись проводится от афферентного батона, в режиме регистрации от всей клетки наблюдаются небольшие емкостные переходные процессы. На этом рисунке показан типичный переходный процесс, записанный от афферентного волокна.

Начните запись синаптической активности. Если афферентное волокно не проявляет спонтанной активности, деполяризуйте волосковую клетку, применив внеклеточный раствор с более высокой концентрацией калия. На данном рисунке показаны типичные вольт-амперные характеристики для волокон AFF слева и внутренних волосковых клеток справа.

Зависимости тока от напряжения регистрировали при удерживающем потенциале -84 mV с шагами напряжения от -124 mV до +36 mV с шагом 10 mV. Значения напряжений указаны справа от некоторых кривых, демонстрирующих вольт-амперные характеристики афферентного волокна. Обратите внимание, что возбуждающие постсинаптические токи (EPSCs) наблюдаются при большинстве шагов напряжения.

ЭПС сменили полярность на положительную примерно при +6 мВ. Эта запись была проведена в присутствии тетродотоксина для блокирования вольтаж-зависимых натриевых токов; без блокатора в записи дополнительно появились бы быстроактивируемые входящие натриевые токи, что позволило бы идентифицировать запись как запись с афферентного волокна. Обратите внимание на медленно активирующийся входящий ток при гиперполяризующих напряжениях.

Данный ток отсутствует во внутренних волосковых клетках или поддерживающих клетках, что является хорошим показателем того, что запись была получена с афферентного волокна. На этих записях представлены вольт-амперные характеристики внутренней волосковой клетки. Стрелка указывает на быстро активируемые выходящие калиевые токи при положительных потенциалах.

За ними следуют калийные токи замедленного выпрямления, возникающие из-за малого диаметра пипетки и высокого сопротивления доступа. Токи внутренних волосковых клеток, представленные здесь, меньше ожидаемых для получения точных записей токов внутренних волосковых клеток. Следует использовать пипетки с более низким сопротивлением доступа.

Однако представленные здесь записи демонстрируют, что вольт-амперные характеристики внутренних волосковых клеток и афферентных волокон можно четко дифференцировать. На этом рисунке показаны синаптические токи, зарегистрированные с афферентного волокна. Обратите внимание на вариабельность размера и формы EPC.

Регистрация проводилась при комнатной температуре с применением тетродотоксина для блокирования потенциалзависимых натриевых токов. На данном рисунке показана одновременная регистрация сигналов от внутренней волосковой клетки и контактирующего с ней афферентного батона. Ступенчатая деполяризация использовалась для деполяризации внутренней волосковой клетки, в ответ на которую регистрировались входящие кальциевые токи; приток кальция в внутреннюю волосковую клетку приводит к высвобождению нейромедиатора и активации EPC в афферентном батоне.

Обратите внимание на синаптическую депрессию, возникающую при 50 миллисекундной деполяризации внутренних волосковых клеток во время выполнения данной процедуры. Важно помнить о необходимости осторожности при диссекции и подготовке тканей улитки, а также сохранять терпение и оптимизм при попытках регистрации сигналов с афферентных терминалей.