Экран с высоким Пропускная Biomining Целлюлаза активность метагеномных из библиотеки

Общая цель данной процедуры — идентификация клонов, экспрессирующих целлюлазу, из метагеномной библиотеки. Это достигается путем репликации ранее созданной метагеномной библиотеки с помощью робота после инкубации реплицированной библиотеки при 37 °C в течение 24 часов. Измеряют рост клонов E. coli, после чего в реплицированную библиотеку добавляют лизис-буфер и субстрат.

В конечном итоге можно получить результаты, демонстрирующие активность целлюлазы с помощью колориметрических измерений абсорбции на планшетном ридере. Здравствуйте, я Кит из лаборатории Стивена Халлема факультета микробиологии и иммунологии Университета Британской Колумбии. Сегодня мы продемонстрируем вам процедуру высокопроизводительного функционального скрининга метагеномных библиотек.

В нашей лаборатории мы используем данную процедуру для изучения активности целлюлазы биомин из метагеномных библиотек. Итак, приступим. Перед началом выполнения данного протокола подготовьте метагеномную библиотеку, хранящуюся в формате 384-луночного планшета.

В данном исследовании в качестве вектора использовался PCC one copy control SMID, а в качестве организма-хозяина для библиотеки — резистентные к Farge T one клетки E. coli TRANSFECT max EPI 300 T one. Для начала процедуры извлеките чашки с библиотекой из морозильника при -80 °C и разморозьте их при 37 °C в течение примерно 20 минут. Тем временем используйте функцию ультрафиолетовой стерилизации на приборе QIX two для стерилизации робота в течение 15 минут. Подготовьте Q fill three в соответствии с инструкциями производителя, подключив флакон со средой к коллектору с помощью стерильных трубок согласно программе.

Наполните Q fill three соответствующим количеством среды и установите объем заполнения 45 µL. В каждой лунке удалите воздух из трубок и коллектора, используя функцию продувки робота, до появления среды. Используя Q fill three, заполните требуемое количество планшетов средой LB через каждый пин коллектора.

Заполнение каждой планшетки занимает примерно 20 секунд. Затем поместите планшетки с библиотекой и чистые планшетки в соответствующие области Q-picks. Загрузите в ванночки для промывки соответствующие реагенты с помощью робота.

2% micro 90 в задней ванночке, автоклавированная дистиллированная вода в средней ванночке и 80% ethanol в передней ванночке. Используя программу репликации qix two, выберите подходящую головку, а также количество и типы исходных и целевых планшетов. Также настройте очистку головки между репликациями.

Обычно достаточно шести циклов в каждой ванне. Вместимость аппарата составляет 10 планшетов одновременно. Запустите аппарат.

Процесс репликации займет примерно 15 минут. Используйте 384-игольчатый пин-инструмент для полной загрузки. После репликации планшетов инкубируйте их при 37 °C в течение 24 часов в камере влажности.

Длительное время инкубации необходимо, так как при добавлении арабинозы индуцируется большое количество копий smid. Тем временем очистите робота Q fill three, как описано в письменном протоколе. По завершении инкубации извлеките планшеты из инкубатора при 37 °C.

Отложите крышки и установите планшеты на платформу загрузки магазина, входящую в состав системы rapid stack. Обязательно следите за порядком расположения планшетов, так как программное обеспечение не фиксирует его. Считывание будет начинаться с планшетов, находящихся в нижней части стопки.

Сначала извлеките один магазин из быстрого стека. Убедитесь, что он пуст, и поместите его на стопку планшетов, предназначенных для считывания. Возьмите магазин за ручку, чтобы планшет загрузился в него.

Загрузите магазин в автоматический стекер, соблюдая правильную ориентацию. Откройте программу для сканирования на подключенном компьютере. Выберите «Новая сессия» (new session) и присвойте ей соответствующее название.

В качестве планшета выберите 384-луночный планшет с плоским дном. Введите данные в области схемы расположения лунок. Нажмите кнопку мастера и выберите этот вариант, чтобы добавить на планшет 384 неизвестных образца.

В области протокола выберите опцию цикла по лункам (well loop) и укажите 384 лунки. В дереве потока в левой части экрана появится значок цикла по лункам. Выберите этот значок и нажмите, чтобы добавить фотометрическое измерение.

Установите длину волны считывания на 600 нанометров. Сохраните протокол под уникальным именем и закройте программу сканирования. Затем откройте программу polara RS.

На главной странице представлена таблица со списком приборов, подключенных к устройству rapid stack; в разделе VARI scan нажмите на опцию run session. После этого должно появиться окно анализа с блок-схемой в центре. Выберите пункт run session, затем найдите название сохраненного сканирования.

Его следует запустить с помощью выпадающего меню, которое появляется в правой части экрана. После выбора протокола нажмите кнопку «Run». Затем появится окно с запросом о том, какой магазин использовать в качестве источника и какой магазин пуст.

Нижнее окно на экране соответствует переднему магазину планшетов. Убедитесь, что и автоматический стекер (rapid stack), и сканер Vario включены, и нажмите «Пуск» (start). Автоматический стекер самостоятельно загрузит планшеты в планшетный ридер, что обеспечит непрерывное измерение образцов в планшетах.

Проследите за загрузкой первой планшета в Vario scan, чтобы убедиться в правильном выравнивании приборов для считывания. Считывание 25 планшетов занимает примерно 50 минут. После завершения сканирования в Vario scan извлеките полный магазин и поместите его на платформу для загрузки магазинов.

Приподнимите внешний прямоугольник платформы, и магазин должен соскользнуть, оставив планшеты стопкой посередине. Наконец, закройте планшеты крышками для проведения скрининга в растворе. Для определения целлюлозной активности сначала приготовьте реакционную смесь, используя готовый 10-кратный стоковый раствор для лизиса.

Добавьте 50 мМ ацетатный буфер с калия при pH 5.5, как описано в письменном протоколе. Затем приготовьте стоковый раствор хромогенного субстрата биоцида клеток DIPHENYL или DNP в DMSO в концентрации до 75 мг/мл, убедившись, что субстрат полностью растворился. Добавьте стоковый раствор биоцида клеток DNP в реакционную смесь до конечной концентрации 0,1 мг/мл.

Имейте в виду, что для каждого планшета требуется примерно 20 миллилитров раствора, и дополнительные 50 миллилитров необходимы для компенсации мертвого объема. С помощью Q fill three распределите смесь для анализа по каждому планшету, как и прежде. Заполнение каждого планшета занимает примерно 20 секунд.

После добавления смеси для анализа инкубируйте планшеты при 37 °C в течение 12–16 часов. Извлеките планшеты из инкубатора при 37 °C, используя камеру влажности. Снимите крышки и установите планшеты на платформу загрузки магазина, входящую в комплект RapidStack, таким же образом, как и ранее.

Откройте программу сканирования и настройте ее так же, как это было сделано ранее, за исключением фотометрического измерения, которое должно быть установлено на 400 nanometers. Затем введите параметры в программу POLARA RS, как было продемонстрировано ранее.

Позвольте сканеру Vario считать планшеты. После завершения цикла снимите и утилизируйте планшеты. Чтобы экспортировать данные по абсорбции, откройте программное обеспечение ScanIt RE и выберите соответствующий пункт.

Откройте существующий файл. Выберите каталог, в котором был сохранен сеанс, и нажмите на значок «плюс», чтобы развернуть список. Под заголовком Title будут расположены опции с названиями container one по container N. В зависимости от количества планшетов выберите в строке меню в верхней части страницы первый планшет для анализа, затем выберите export data report.

Выберите параметры экспорта, такие как схема планшета и фотометрические данные. Нажмите «view report» (просмотр отчета), затем «file save» (сохранить файл). Выберите нужный каталог.

Форматом выходных данных является электронная таблица Microsoft Excel. Здесь представлены значения абсорбции с одного 384-луночного планшета, содержащего положительный клон; как показано, положительные клоны демонстрируют заметное увеличение абсорбции по сравнению с клонами, не обладающими целлюлазной активностью.

Различия в продолжительности анализа, номере лунки, ее расположении на планшете или концентрации DNP могут влиять на абсолютные значения оптической плотности. Относительные показатели поглощения, такие как разница между значением поглощения и средним значением по планшету или по столбцу, являются более надежным методом идентификации клонов, продуцирующих целлюлазу. Мы только что продемонстрировали вам способ идентификации клонов с положительной активностью целлюлазы из метагеномной библиотеки.

При выполнении данной процедуры важно не забыть растворить DNP cell bio в DMSO и инкубировать планшеты в увлажнителе. На этом всё. Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.