Количественная оценка дцДНК использованием Hitachi F-7000 Флуоресцентный спектрофотометр и PicoGreen Dye
5 ноября 2010 г.
Демонстрация количественное двухцепочечной ДНК с использованием молекулярных зондов PicoGreen красителя и Hitachi F-7000 флуоресценции Спектрофотометр оснащен аксессуар микропланшетов читателя.
Общая цель данной процедуры — продемонстрировать возможность использования флуоресцентного спектрофотометра F 7, 000 с ридером микропланшетов для количественного определения двухцепочечной ДНК с помощью красителя Pico green. Для этого сначала подготавливают образцы и реагенты, а вторым этапом процедуры выполняется настройка прибора.
Третьим этапом процедуры является загрузка образцов в планшетный ридер. Заключительным этапом процедуры является проведение измерений стандартов и образцов. В итоге можно получить результаты, демонстрирующие линейную калибровочную кривую, которая может быть использована для количественного определения двухцепочечной ДНК в неизвестных образцах.
Включите спектрофлуориметр Hitachi F 7, 000, чтобы дать ксеноновой лампе прогреться в течение одного часа. Создайте в Excel файл со стандартами и данными образцов и сохраните его в формате значений, разделенных запятыми, или CSV. Для настройки флуориметра сначала нажмите кнопку «method» (метод), которая открывает окно метода анализа.
В поле измерения выберите «фотометрия» из раскрывающегося списка. Затем перейдите на вкладку «количественный анализ». В поле типа количественного анализа выберите «длина волны», чтобы указать, что измерение флуоресценции будет проводиться на заданной длине волны.
В качестве типа калибровки выберите «первый порядок» (first order), а в поле количества длин волн выберите «одна» (one). В качестве единицы измерения концентрации введите нанограммы на миллилитр. Убедитесь, что флажки «ручная калибровка» (manual calibration) и «проведение кривой через ноль» (force curve through zero) не отмечены. В поле количества знаков после десятичной запятой выберите «два», в поле нижнего предела концентрации введите 0, а в поле верхнего предела концентрации — 10 000.
Затем перейдите на вкладку «Instrument» и в поле «Data mode» выберите «Fluorescence». Убедитесь, что поле «Chopping speed» неактивно, так как оно используется только для измерений фосфоресценции. В поле «Wavelength mode» выберите «WL fixed»; в поле «Ex WL» введите 480 nanometers, а в поле «EM WL» — соответствующее значение.
Введите 520 nanometers. Оставьте все остальные поля в разделах EX и EM неактивными. Установите ширину щели возбуждения (ex slit) и щели эмиссии (EM slit) на 5.0 nanometers.
С помощью выпадающих меню оставьте незаполненным поле перед значением напряжения ФЭУ от 1 до 1000 вольт. Для напряжения ФЭУ выберите в выпадающем меню значение 700 вольт. Также выберите два для количества автоматических статистических расчетов, один для количества повторов, 0.1 seconds для времени интегрирования и ноль для задержки.
Теперь откройте вкладку монитора (monitor) и установите максимальное значение по оси Y на 10 000, а минимальное — на ноль. Затем отметьте флажком пункт «open data processing after data acquisition» (открыть обработку данных после сбора данных), а при необходимости — пункт «print report after data acquisition» (распечатать отчет после сбора данных) для автоматического вывода отчета по завершении считываний. Наконец, чтобы сохранить все выбранные параметры на различных вкладках окна метода анализа, перейдите на вкладку «general» (общие) и сохраните данные под новым именем файла в указанном месте.
Нажмите кнопку «ОК», чтобы закрыть это окно. На этом настройка параметров тестирования прибора завершена. Для настройки планшетного ридера нажмите кнопку MPR, чтобы вывести окно настроек MPR на передний план.
Сначала выберите лунки для стандартов. Например, щелкните по позиции A1 и перетащите курсор мыши к E1. Затем нажмите кнопку «standard set» (набор стандартов).
Это позволит выбрать позиции для стандартов, которые будут выделены зеленым цветом. Затем выберите позиции для образцов. Аналогично, нажмите и перетащите курсор мыши по соответствующим позициям на планшете, а затем нажмите кнопку «sample set», после чего выбранные позиции автоматически подсветятся желтым цветом.
Повторяйте эту операцию для всех позиций необходимых измерений образцов. Чтобы загрузить информацию о стандартах и образцах в ранее подготовленный файл с разделителями-запятыми, перейдите на вкладку с информацией о лунках (well information) в окне настроек MPR.
Нажмите кнопку загрузки информации о лунках, после чего откроется окно проводника Windows для выбора файла с информацией о лунках в формате .csv. После загрузки данных информация должна отобразиться в виде таблицы. Для приготовления рабочего раствора реагента Pico green добавьте 50 µL 200 X реагента Pico green к 9,95 mL TE-буфера.
Для построения стандартной кривой подготовьте серийные разведения двухцепочечной ДНК Lambda в буфере TE с конечными концентрациями от 1 до 100 ng/mL. Пипеткой перенесите 150 µL каждого стандарта в соответствующие лунки планшета на 96 лунок. Затем перенесите по 150 µL каждого исследуемого образца в соответствующие назначенные лунки планшета. С помощью многоканального дозатора добавьте по 150 µL раствора PicoGreen в каждую лунку, после чего перемешайте раствор и образцы ДНК.
Осторожно инкубируйте планшет в темном месте от двух до пяти минут для протекания реакции. Нажмите кнопку экрана отображения MPR, чтобы вывести окно настройки MPR на передний план, и нажмите кнопку смены позиции. Платформа для удержания микропланчин переместится к передней части прибора; откройте дверцу микропланшетного ридера, поместите 96-луночный планшет на платформу так, чтобы лунка A1 была направлена вперед, и закройте дверцу микропланшетного ридера.
Нажмите кнопку начального положения, чтобы поместить позицию A микропланшета в позицию измерения. Нажмите кнопку отображения на мониторе, чтобы вывести окно измерения на передний план. Нажмите кнопку измерения, чтобы начать измерение стандартов и неизвестных образцов.
Качество калибровочной кривой оценивается с помощью различных параметров, предоставляемых программным обеспечением F 7, 000. Например, эта идеальная калибровочная кривая, полученная для количественного определения двухцепочечной ДНК с использованием красителя Pico Green, имеет рассчитанный коэффициент детерминации 0,99993. Описанная высокопроизводительная система представляет собой серийную сборку технологий, включающую краситель Pico Green, флуорисцентный спектрофотометр Hitachi F 7, 000, оснащенный считывателем микропланшетов, и программное обеспечение для автоматизации сбора, хранения, анализа и представления данных.
Комбинация мощных технологий позволяет удовлетворить растущую потребность в точном анализе небольших количеств двухцепочечной ДНК.
Обзор
В данной статье продемонстрирован метод количественного определения двухцепочечной ДНК (дцДНК) с использованием красителя PicoGreen и флуоресцентного спектрофотометра Hitachi F-7000 с микропланшетным ридером. В процедуре описаны подготовка образцов, настройка прибора и процессы измерения для получения линейной калибровочной кривой для количественного анализа дцДНК.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Флуоресцентная спектроскопия
- Количественное определение ДНК
- Технология микропланшетного ридера
Теоретические основы
- Краситель PicoGreen представляет собой чувствительный флуоресцентный краситель, используемый для количественного определения dsDNA.
- Hitachi F-7000 — это универсальный флуоресцентный спектрофотометр.
- Точное количественное определение ДНК имеет важное значение для различных биологических экспериментов.
- Высокопроизводительные системы упрощают одновременный анализ множества образцов.
Цель исследования
- Продемонстрировать возможности спектрофотометра F-7000 для количественного определения dsDNA.
- Разработать надежный метод измерения неизвестных образцов ДНК.
- Построить линейную калибровочную кривую для точного количественного анализа.
Используемые методы
- Приготовление реагента PicoGreen и стандартов ДНК.
- Настройка параметров спектрофотометра Hitachi F-7000.
- Загрузка образцов в планшетный ридер.
- Измерение флуоресценции для построения калибровочной кривой.
Основные результаты
- Для количественного определения dsDNA была построена линейная калибровочная кривая.
- Метод продемонстрировал высокую чувствительность и точность.
- Результаты показали коэффициент детерминации 0,99993.
- Система эффективно анализировала малые количества dsDNA.
Выводы
- Комбинация красителя PicoGreen и спектрофотометра F-7000 представляет собой надежный метод количественного определения ДНК.
- Этот высокопроизводительный подход отвечает требованиям к точности анализа в биологических исследованиях.
- Данный метод может быть применен в различных исследованиях, требующих точных измерений содержания ДНК.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Точное количественное определение двухцепочечной ДНК является основополагающим требованием для валидации мишеней, разработки анализов и создания доклинических моделей в сфере биофармацевтических исследований и разработок. Флуоресцентный спектрофотометр Hitachi F-7000 с использованием красителя PicoGreen обеспечивает высокочувствительное и высокопроизводительное измерение dsDNA, что позволяет надежно строить стандартные кривые для последующих приложений. Данный метод обеспечивает прогностическую достоверность количественного анализа нуклеиновых кислот, снижая вариативность в рабочих процессах на ранних стадиях поиска и позволяя масштабировать воспроизводимое получение данных при скрининге соединений и исследованиях биомаркеров.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишени
- Научная ценность: обеспечивает точное измерение концентрации днДНК для клонирования, трансфекции и анализа валидации мишеней с помощью ПЦР.
- Практическая ценность: поддерживает воспроизводимую подготовку и количественное определение образцов, снижая техническую вариабельность в экспериментах по проверке гипотез.
- Прогностическая ценность: позволяет строить линейные калибровочные кривые с высокими коэффициентами детерминации (R² > 0.999), что гарантирует точный количественный анализ неизвестных образцов в исследованиях взаимодействия с мишенью.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: обеспечивает количественные показатели флуоресценции, совместимые с 96-луночными форматами, для стандартизации анализа и титрования реагентов.
- Практическая ценность: позволяет быстро измерять 96 лунок менее чем за 60 секунд в кинетическом режиме, что обеспечивает готовность к высокопроизводительному скринингу.
- Масштабируемость: программное обеспечение позволяет сохранять и вызывать конфигурации микропланшетов, что облегчает единообразную настройку анализа для различных групп и проектов.
Трансляционные и доклинические исследования
- Трансляционная преемственность: обеспечивает надежный количественный анализ dsDNA для исследования биомаркеров, валидации ПЦР и производства векторов в доклинических моделях.
- Минимизация рисков: высокая чувствительность (50 пикомолей эквивалента флуоресцеина) и широкий динамический диапазон (5 порядков величины) позволяют точно проводить количественную оценку серий разведений, сокращая число ложноотрицательных результатов для мишеней с низкой экспрессией.
- Интеграция в рабочий процесс: вывод данных в формат Excel или отчеты обеспечивает беспрепятственную передачу в биоинформационные и аналитические конвейеры.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный метод вписывается в континуум открытий — от ранней валидации мишеней и идентификации соединений-лидеров до доклинических разработок, где точное количественное определение нуклеиновых кислот имеет решающее значение для воспроизводимости экспериментов и целостности данных.
- Фундаментальная биология: облегчает проверку гипотез, обеспечивая точное измерение dsDNA для оценки эффективности клонирования, анализа экспрессии генов и исследований мутагенеза.
- Скрининг: обеспечивает воспроизводимые количественные показатели флуоресценции, что гарантирует надежность анализа и позволяет проводить нормализацию библиотек соединений.
- Аналитика: позволяет строить линейные калибровочные кривые и определять коэффициенты детерминации (R²), что необходимо для сравнения результатов различных экспериментов и контроля качества.
- Трансляционные исследования: обеспечивает преемственность на доклиническом этапе за счет надежного количественного определения DNA в лекарственных препаратах, вирусных векторах и биомаркерных анализах.
- Корпоративное повторное использование: настраиваемое программное обеспечение и стандартизированные протоколы позволяют использовать методику в разных подразделениях, сокращая необходимость повторной разработки методов и повышая операционную эффективность.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Высокая чувствительность и специфичность к dsDNA снижают количество ложных сигналов и повышают достоверность данных в молекулярных анализах.
- Операционная ценность: Автоматизированный сбор, хранение и представление данных с помощью программного обеспечения сводят к минимуму ручные операции и ошибки при переносе данных.
- Стратегическая ценность: Надежное количественное определение поддерживает принятие решений о продолжении или прекращении разработки при оптимизации ведущих соединений, обеспечивая точное дозирование и нормализацию в функциональных анализах.
- Влияние на портфель: Позволяет проводить приоритизацию с учетом рисков, предоставляя достоверные данные о нуклеиновых кислотах для отбора кандидатов и исследований по разработке лекарственных форм.
Особенности реализации
- Требуется владение методами флуоресцентной спектроскопии и навыками работы с планшетным ридером.
- Необходим доступ к спектрофотометру Hitachi F-7000 с аксессуаром для чтения микропланшетов и совместимым программным обеспечением.
- Требуется стандартизированная подготовка реагентов (разведение PicoGreen в TE-буфере) и соответствующее обращение с образцами во избежание тушения флуоресценции.
- Включает оптимизацию времени инкубации (2–5 минут в темноте) и настроек длины волны (Ex 480 nm, Em 520 nm) для обеспечения стабильности сигнала.
- Включает практические ограничения, такие как необходимость инкубации в темноте и возможность влияния загрязнителей или органических растворителей.
