Использование потоков для слива воды и вращающихся дисков для реакторов Золотистый стафилококк Биопленка Анализ

Общая цель данной процедуры — выращивание бактериальных биопленок в условиях низкого или умеренного напряжения сдвига с использованием либо капельного проточного биореактора, либо реактора с вращающимся диском. Купоны в биореакторе сначала инокулируют бактериями и инкубируют при 37 °C, чтобы бактериальные клетки могли прикрепиться к поверхностям роста. После прикрепления клеток к купонам запускается поток питательной среды, создающий напряжение сдвига, которое воздействует на систему в процессе развития биопленки.

Затем зрелые биопленки можно собрать для анализа и наблюдения. Для определения ультраструктуры полученных биопленок можно использовать сканирующую электронную микроскопию. Я — Блейз Боллз.

Основным преимуществом данного метода по сравнению с существующими способами, такими как использование проточных камер, является возможность легко достичь высокого выхода биомассы и создать несколько идентичных биопленок. Эту процедуру продемонстрируют Рэйчел Стивенсон и Келли Шварц, техник и аспирант моей лаборатории. Реактор для биопленок с капельным потоком состоит из четырех камер с входными портами для подачи среды и выходными портами для удаления отходов.

Внутри каждой камеры находится съемный купон, на котором растет биопленка. Для сборки реактора биопленки с капельным потоком поместите купоны в каждую параллельную камеру и закройте крышки камер. Простерилизуйте собранный реактор, а также трубки для подачи питательных веществ в автоклаве перед использованием системы.

Также автоклавируйте среду для роста биопленки для инокуляции стерилизованного реактора с капельным потоком. Установите аппарат на плоскую поверхность и зажмите линии слива. Затем заполните каждую камеру 10 milliliters стерильной среды для роста на основе триптиказно-соевого бульона и добавьте 100 microliters staphylococcus aureus.

Ночную культуру, выращенную в той же среде, вносят в каждую камеру по отдельности. Поместите инокулированный реактор в инкубатор при 37 °C на 18 часов, чтобы клетки могли прикрепиться к поверхности купона. После инкубации снимите зажим с трубки для оттока и установите реактор на деревянный наклонный блок под углом 10 градусов. Действуйте асептически.

Подсоедините трубку для подачи питательной среды к флакону с питательным бульоном для непрерывного потока. Пропустите трубку через насос и заполните ее, запустив насос на полной скорости. После заполнения трубки остановите насос и прикрепите к концу каждой трубки иглы 22G длиной один дюйм.

Асептически протрите пробку входного отверстия камеры салфеткой, смоченной в этаноле. Вставьте иглы через входную пробку. Включите насос и дождитесь, пока среда начнет капать на образцы.

При скорости потока примерно 125 µL в минуту среда должна течь вниз от входного порта с пробкой к выходному порту. Эксплуатируйте реактор в режиме непрерывного потока в течение трех дней, периодически проверяя правильность дренажа реактора.

Дренаж проверяют путем визуального осмотра камер, чтобы убедиться, что среда не скапливается в них. Если среда скапливается, пережатие выпускного трубопровода обычно способствует правильному дренажу для сбора биопленок; в этом случае следует остановить насос и извлечь иглы из реактора. Затем установите реактор на плоскую поверхность.

После трех дней непрерывного потока биопленки Staphylococcus aureus выглядят как желтая биомасса, распределенная по всей длине инокулированных образцов. На сканирующей электронной микрофотографии биопленки видно, что Staphylococcus aureus покрывает образец, образуя ассоциированное с поверхностью сообщество биопленки. Чтобы количественно определить полученную биомассу, с помощью стерильного пинцета асептически извлеките образцы, соберите бактерии с помощью скребка для клеток, затем перенесите их в коническую пробирку, содержащую 5 мл стерильного PBS.

С помощью гомогенизатора тканей разобщите бактериальные агрегаты до получения однородной суспензии. Количество колониеобразующих единиц определяют путем высева серийных разведений на чашки с триптическим соевым агаром с последующей инкубацией в течение 24 часов при 37 °C и подсчетом колоний. Реактор биопленки с вращающимся диском состоит из хемостата, через который перекачивается питательная среда.

Вращающийся диск со звездообразной перегородкой и 18 купонов, предназначенных для установки в этот диск. Для сборки реактора сначала поместите купоны в пазы вращающегося диска. Затем поместите заполненный диск в стеклянный стакан объемом 1 л с переливным отверстием и закройте реактор резиновой пробкой №15 с одним отверстием для потока среды и одним отверстием для аэрации.

Стерилизуйте в автоклаве собранный реактор и входные трубки. Для инокуляции реактора наполните стакан 250 milliliters стерильной питательной среды и добавьте 500 microliters ночной культуры staphylococcus aureus, выращенной в триптиказ-соевом бульоне. Поместите реактор на магнитную мешалку, установив скорость 250 rotations per minute, и инкубируйте в течение ночи при 37 degrees Celsius, чтобы обеспечить адгезию клеток к образцам.

После инкубации в течение ночи подсоедините входную трубку к порту резервуара со средой и к перистальтическому насосу. Включите насос и установите скорость потока на 0.25 milliliters per minute. Оставьте реактор работать в течение 24 часов при 37 degrees Celsius для сбора полученных биопленок.

Остановите реактор и в асептических условиях снимите диск, не касаясь образцов. С помощью стерильного пинцета извлеките образцы и осторожно погрузите каждый из них в стерильный PBS, чтобы удалить слабо прикрепившиеся бактерии перед тестированием противомикробных соединений.

В асептических условиях поместите купоны в отдельные лунки 96-луночного планшета, содержащего интересующие соединения. Инкубируйте планшет в течение четырех часов при 37 °C. Затем перенесите купоны в микроцентрифужные пробирки объемом 1.5 мл, содержащие 1× PBS, и диспергируйте биопленки с помощью гомогенизатора.

Наконец, высейте серийные разведения клеток на питательный агар для определения количества жизнеспособных колониеобразующих единиц в образце, как было описано ранее. На данном графике показано количество колониеобразующих единиц в биопленках, подготовленных с использованием реактора с вращающимся диском и подвергнутых воздействию перекиси водорода, что демонстрирует возможность получения до 18 идентичных биопленок. Использование реактора с вращающимся диском делает данный метод идеальным для тестирования противомикробных соединений.

После просмотра этого видео вы должны хорошо понимать принципы работы с биопленками в реакторах с капельным потоком и вращающимся диском. Эти реакторы для выращивания биопленок являются альтернативой биопленкам в проточных кюветах и микротитрационных планшетах; они идеально подходят для случаев, когда требуется большое количество биомассы биопленки или необходимо провести тестирование антимикробных препаратов на сформированных биопленках.