Подкожный Заражение метициллину Staphylococcus Aureus устойчивы (MRSA)

Общая цель следующего эксперимента заключается в изучении выживаемости и распространения метициллин-резистентного Staphylococcus aureus или MRSA, а также уровней хемокинов и цитокинов в местах инфицирования. Для этого шерсть удаляют со спины мышей, чтобы обеспечить четкую область наблюдения. В качестве второго шага.

Суспензию MRSA вводят мышам подкожно через три дня после инфицирования; патологии инфекции и количество бактерий оценивают путем определения числа колониеобразующих единиц в гомогенатах тканей на агарных пластинках. Здравствуйте, как ваши дела? Меня зовут Де Лордон.

Я научный сотрудник последипломного образования. Здравствуйте, меня зовут Мариэль Санчес. Я аспирантка, а я — Андреа Худа.

Я научный сотрудник из лаборатории Джорджа Ли на кафедре педиатрии Медицинского центра Седар-Синай. Данный метод может помочь в поиске ответов на ключевые вопросы медицинской науки, такие как моделирование тяжелых инфекций, включая миозит, полимиозит и некротизирующий фасциит. Хотя этот метод позволяет глубже понять механизмы тяжелых экстренных инфекций, его также можно применять к другим системам, таким как Streptococcus pyogenes группы A и другие организмы.

Кроме того, мы можем изучать функции и патогенез других организмов, вызывающих миозит и полимиозит. Как правило, лица, впервые выполняющие эту процедуру, могут столкнуться с трудностями, поскольку один из глобальных регуляторов областей каукуса обладает высокой изменчивостью. Если не принять меры предосторожности, собранные данные могут иметь значительный разброс, что затруднит их интерпретацию.

Приступим. В лаборатории уровня биобезопасности BSL-2 подготовьте чашку с кровяным агаром овцы на основе TSA и стерильную петлю, используя замороженный блок. Извлеките стоковую культуру Mercer из морозильника при температуре -80 °C.

Затем с помощью стерильной петли перенесите небольшой кусочек льда из стоковой культуры на чашку. После получения небольшого фрагмента стоковой культуры Mercer немедленно верните ее обратно в морозильную камеру, чтобы избежать размораживания, так как повторные циклы замораживания и оттаивания повредят стоковую культуру. Используйте петлю для посева на агар, чтобы обеспечить рост отдельных колоний Mercer.

Инкубируйте планшет при 37 °C в течение ночи без добавления CO2. На следующий день подготовьте и промаркируйте новый чашку с кровяным агаром, чашку с TSA и пробирку с защелкивающейся крышкой объемом 15 мл, содержащую 3 мл THB.

Возьмите чашку с M SSA, на которой культуры росли в течение ночи, и изучите гемолитический фенотип колоний. С помощью стерильной петли выберите колонию, фенотип которой соответствует фенотипам колоний из предыдущих экспериментов. Инокулируйте THB выбранной колонией, используя ту же петлю для посева штрихом.

Инкубируйте чашку с раствором THB при 37 °C в течение ночи при встряхивании со скоростью 220 об/мин. Эти бактерии будут использованы для инокуляции культуры для подкожного инфицирования мышей на последующих этапах. Также поместите чашку с кровяным агаром в инкубатор.

Планшет будет использован на следующее утро, чтобы подтвердить, что гемолитический фенотип бактерий в растворе THB соответствует фенотипу изначально выбранной колонии. Если фенотип гемолиза не совпадает с исходным клоном, не приступайте к эксперименту. Переместите мышь на платформу и выбрейте шерсть на спине.

Если животное проявляет чрезмерную агрессивность, может потребоваться седация изофлураном. Нанесите примерно 5 мм³ крема для удаления волос, например NA, на выбритый участок. Препарат NA можно приобрести в местной аптеке.

Убедитесь, что вы приобрели крем для удаления волос, содержащий детское масло, так как продукт без него окажется слишком раздражающим для мышей. Оставьте крем на поверхности кожи примерно на одну минуту; пока крем действует, смочите несколько бумажных полотенец дважды дистиллированной водой. Спустя минуту используйте влажные бумажные полотенца, чтобы тщательно очистить выбритую область.

Убедитесь, что на коже не осталось крема для удаления волос. Предварительно прогрейте 10 мл THB в пробирке с завинчивающейся крышкой объемом 50 мл при 37 °C в бактериологическом инкубаторе в течение от 4 до 10 часов. Перенесите 20 мкл ночной бактериальной культуры в предварительно прогретый THB. Это разбавит ночную культуру.

Подготовьте суспензию в разведении от 1 к 500. Поместите пробирку при температуре 37 °C в инкубатор-шейкер при 220 об/мин примерно на два с половиной — три часа. После периода инкубации используйте дополнительный THB для дальнейшего разбавления бактериальной суспензии до 1 к 10 и измерьте плотность суспензии с помощью спектрофотометра.

С измерением поглощения при 514 нм. Продолжайте инкубировать суспензию при 37 °C с перемешиванием при 220 об/мин до тех пор, пока суспензия в разведении 1:10 не достигнет значения 0,25. Чтобы собрать клетки, центрифугируйте пробирку объемом 50 мл при 3 225 ×g в течение 10 минут при 4 °C, удалите супернатант и ресуспендируйте осадок.

Суспендируйте бактериальный осадок в 10 миллилитрах DPBS и повторно промойте бактерии, повторив этап центрифугирования для этой модели тяжелой инфекции. Снова суспендируйте бактериальный осадок примерно в одном миллилитре DPBS, чтобы получить концентрацию около 1 × 10¹⁰ колониеобразующих единиц на миллилитр. Подготовьте чашки с кровью овцы A-R-T-S-A, проведите серийное разведение бактерий от 10⁻¹ до 10⁻⁸ в DPBS и высейте на чашки.

Нанесите капли по 10 µL серийно разведенной бактериальной суспензии на чашку с кровяным агаром в трех повторностях. Инкубируйте чашки при 37 °C в течение ночи. После инкубации в течение 16–18 часов определите и зафиксируйте фенотип гемолиза инокулята.

Подсчитайте количество колониеобразующих единиц на чашках. Титр инфекционного инокулята будет рассчитан на основании количества колониеобразующих единиц на чашках.

Подготовьте шприц со 100 µL бактериальной суспензии в DPBS, приготовленной ранее. Перед инъекцией мышей следует подвергнуть седации до достижения частоты дыхания примерно один раз в секунду. Для демонстрации в данном видео показана эвтаназированная мышь.

Введите M ser в один бок после инъекции. Поместите мышь обратно в клетку. Наблюдайте за животными в течение трех-пяти часов после инъекции, чтобы убедиться, что мышь жива, прежде чем возвращать её в виварий.

Ежедневно контролируйте состояние поражений на спинах животных после их жертвования. Измерьте и зафиксируйте размер и состояние поражений кожи. Площадь поражения кожи и мышечной ткани количественно определяется путем перемножения длины и ширины поражения в миллиметрах.

Очаги неправильной формы необходимо разделить на более мелкие симметричные фрагменты, и каждый фрагмент измерить одним и тем же методом. Подготовьте микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 миллилитра, containing 100 µL DPBS для сбора тканей. Сделайте надрез на коже стерильным лезвием бритвы и иссеките очаг стерильными ножницами.

При иссечении пораженного участка убедитесь, что также удалено примерно два-пять миллиметров здоровой кожи вокруг этой области. Поместите пораженный участок в пробирки для сбора тканей для последующего анализа мышечных поражений. Осторожно снимите кожу, чтобы измерить размер и зафиксировать состояние поражения мышечной ткани.

Извлеките селезенку и почки. Поместите эти ткани в отдельные пробирки для сбора. Гомогенизируйте ткани, перемешивая их с помощью шприца объемом 1 мл в течение приблизительно 30 секунд.

Добавьте по 900 µL DPBS в каждую пробирку. Подготовьте планшеты THA, затем перемешайте гомогенизированные образцы тканей на вортексе в течение пяти минут. Выполните серийное разведение образца.

Подготовьте суспензии с разведением от 1 до 10⁶. В 96-луночные планшеты внесите по 10 µL каждой серийно разведенной суспензии. Инкубируйте планшеты в бактериологическом инкубаторе при температуре 37 °C в течение ночи.

На следующее утро подсчитайте количество колониеобразующих единиц на чашках и рассчитайте общее число колониеобразующих единиц с учетом коэффициентов разведения. При правильном проведении инфицирования сразу после подкожной инъекции на поверхности кожи должна образоваться папула. Если папула не наблюдается, это может означать, что инъекция была сделана слишком глубоко, что может повлиять на результат инфицирования.

Размер поражений и выживаемость бактерий можно оценивать в разные моменты времени после заражения MSA. Следующие поражения кожи были исследованы на третий день после заражения; они представляют собой примеры поражений у мыши линии CD1, которой на один бок было введено 1 × 10⁷ колониеобразующих единиц. Поражения мышц обычно обнаруживаются в тканях под поражениями кожи.

Ниже приведены примеры соответствующих поражений поверхности мышц для ранее представленных фотографий поражений кожи. Это мышечные поражения, наблюдаемые на третий день после инфицирования мыши дозой 1 × 10⁷ колониеобразующих единиц. Площадь поражения определяется как произведение длины на ширину поражения, измеренных в миллиметрах, и может быть использована для оценки повреждения тканей кожи.

Количество колониеобразующих единиц бактерий, локализованных в месте инфекции, можно определить количественно на иссеченных очагах поражения. Подсчет колониеобразующих единиц позволяет определить, обеспечивает ли фактор вирулентности преимущество в выживаемости MSA. При выполнении данной процедуры важно помнить о необходимости соблюдения стандартных мер предосторожности в связи с использованием игл и высокопатогенных микробов при проведении данной манипуляции.

Наконец, модель абсцесса с использованием дозы инокулята, которая в 1 000 раз ниже, чем в нашей основной модели, может быть использована для ответа на дополнительные вопросы, такие как: какие факторы S способствуют персистирующей инфекции RSA? Не забывайте, что работа со шприцами, заполненными Mars A, может быть крайне опасной, поэтому необходимо соблюдать меры предосторожности, такие как утилизация шприца непосредственно в контейнер для острых предметов, чтобы избежать случайного укола иглой. Кроме того, в данном эксперименте важно соблюдать стандартные протоколы BSO2 для обеспечения надлежащей дезинфекции рабочей зоны.

На этом всё. Спасибо за просмотр. Привет. Привет, пока.