РНК-интерференция в клещи

Общая цель данной процедуры — продемонстрировать метод РНК-интерференции у клещей посредством инъекции. Это достигается путем предварительного синтеза двухцепочечной РНК интересующего гена или генов. Затем РНК вводится клещам, после чего их выдерживают в камере влажности в течение 24 часов.

По истечении этого периода выдержки клещам позволяют питаться на животном, например, на овце. Определяют такие параметры питания, как вес, линька и положение яиц, а также экспрессию целевого гена или интересующих генов с помощью ПЦР в реальном времени с обратной транскрипцией (R-T-P-C-R). В конечном итоге можно получить результаты, демонстрирующие влияние сайленсинга целевых генов на биологию клещей путем оценки биологических параметров клещей и экспрессии генов с помощью R-T-P-C-R в реальном времени.

Наша группа работает с клещами, стремясь охарактеризовать молекулярные события на интерфейсе «клещ — патоген», чтобы использовать эти базовые данные для разработки методов борьбы с заражением клещами и передачей патогенов людям и животным. РНК-интерференция стала незаменимым инструментом в этих исследованиях, поскольку это единственный доступный метод генетической манипуляции с клещами. Функции многих генов клещей остаются неизвестными.

РНК-интерференция позволяет определить роль генов клеща и экспрессию генов во многих аспектах биологии клеща, включая спаривание, размножение, питание, пищеварение, функцию слюнных желез, а также векторную компетенцию клеща по передаче патогенов. Процедуру продемонстрирует группа по РНК-интерференции клещей из нашей лаборатории: доктор Ed Lewin, аспирант Busby и я. Для получения двухцепочечной РНК сначала синтезируют олигонуклеотидные праймеры, содержащие последовательности промотора T7 для транскрипции РНК in vitro.

Например, derma center vari lesin. Используйте олигонуклеотидные праймеры D eight A a T 75 и D eight DVT 73, представленные здесь. Амплифицируйте целевой ген с помощью ОТ-ПЦР, используя 10 picomoles каждого олигонуклеотидного праймера и от 1 до 10 nanograms общей РНК клеща.

Затем очистите продукт ПЦР. После этого используйте 8 µL или примерно 100 ng для синтеза двухцепочечной РНК. Чтобы подготовить клещей к инъекции, сначала промойте их в следующей последовательности растворов: водопроводная вода, 3% перекись водорода, дистиллированная вода (дважды), 70% этанол и две финальные промывки дистиллированной водой.

Каждую промывку выполняйте в одноразовой центрифужной пробирке объемом 50 мл путем встряхивания. Затем слейте раствор через мелкую проволочную сетку. Промокните клещей на бумажных полотенцах досуха, после чего распределите их по группам по 20–50 особей в зависимости от целей эксперимента.

Поместите каждую группу в пластиковый стакан объемом 1,25 унции с плотно прилегающей крышкой и подпишите каждый стакан в соответствии с экспериментальной группой. Затем сформируйте группу специалистов по РНК-интерференции (РНКи), состоящую из трех человек, которые будут осуществлять процесс инъекции. Первый человек закрепляет каждого клеща на двустороннем клейком скотче, прикрепленном к листу красного стоматологического воска размером три на шесть дюймов.

Второй специалист вводит препараты клещам, а третий контролирует их после инъекции: воздействует на клещей углекислым газом для их активации, затем подсчитывает их и переносит живых особей в стаканчики, промаркированные номером экспериментальной группы. Все члены команды должны работать в одноразовых перчатках. Для начала процесса инъекции захватите клеща с помощью тонкого пинцета Dumont и поместите его брюшной стороной вверх на двусторонний клейкий скотч, прикрепленный к листу красного стоматологического воска. Расположите клещей плотными группами по пять особей. Накройте ротовые органы всех пяти клещей небольшой полоской малярного скотча.

Для дальнейшей фиксации оставьте большую часть тела открытой, чтобы специалист по инъекциям мог наблюдать за процессом. Чтобы ввести препарат, проколите отверстие в нижнем правом квадранте вентральной поверхности экзоскелета клеща, используя одноразовый инсулиновый шприц с иглой калибра 29G длиной 0,5 дюйма. Затем немедленно введите клещам от 0,2 до 0,5 µL раствора двухцепочечной РНК с помощью специально изготовленного шприца Hamilton и иглы калибра 33G длиной 1 дюйм со скосом 45 градусов; глубоко введите иглу в полость тела клеща, чтобы обеспечить точное размещение и удержание двухцепочечной РНК.

Несмотря на то, что после инъекции жидкость вытекает, глубокое введение иглы обеспечит попадание достаточного количества двухцепочечной РНК в полость клеща для вызывания сайленсинга генов; при этом следует избегать избыточного введения жидкости, которое может привести к потере гемолимфы и гибели клеща. Сразу после инъекции аккуратно поднимите клещей с двухстороннего скотча с помощью тонкого пинцета и поместите их в пластиковый контейнер для восстановления.

После инъекции клещи на некоторое время останутся неактивными, но вскоре должны начать ползать по чашке. Активируйте клещей, выдохнув на них углекислый газ. Как только клещи станут активными и начнут передвигаться, место инъекции быстро заживет, и они, скорее всего, выживут.

Подсчитайте количество клещей в каждой экспериментальной группе и поместите каждую группу в промаркированный пластиковый стакан с плотно прилегающей крышкой. Замените любых погибших клещей в текущей группе перед введением препарата следующей экспериментальной группе. Очистите шприц Гамильтона перед введением препарата следующей экспериментальной группе, наполнив и затем вытеснив из шприца свежий 3% hydrogen peroxide.

15 раз, после чего следует 15 промывок стерильной водой. Следите за тем, чтобы не согнуть поршень шприца Hamilton, иначе поршень будет двигаться рывками и перестанет реагировать на легкое нажатие, необходимое для инъекции клещам. После проведения инъекций поместите клещей в камеру с контейнером, наполненным водой и сульфатом калия, который поддерживает высокую влажность, на один день.

Затем поместите отдельных клещей в кормовые ячейки, прикрепленные к овце, и позвольте им питаться вместе с равным количеством неинъецированных самцов или самок клещей (в зависимости от того, какой пол не подвергался инъекции). Соберите и взвесьте самок клещей из кормовой ячейки после завершения питания, которое длится примерно 10 дней, или когда контрольные самки отпадут от хозяина. Инкубируйте каждую группу клещей в камере влажности до завершения откладки яиц. Оцените откладку яиц по группам, взвесив общую массу яиц, произведенных всеми клещами в группе, чтобы оценить фенотип клещей после кормления.

Определите количество выживших клещей, рассчитайте массу клещей, а также положение яиц и плодовитость. В зависимости от целевого гена и задач исследования могут быть проведены другие анализы для подтверждения сайленсинга генов с помощью R-T-P-C-R. После кормления выделите слюнные железы и кишечник из отдельных клещей групп контрольного введения и введения двухцепочечной РНК, затем экстрагируйте общую РНК из индивидуальных образцов тканей.

Проанализируйте транскрипты целевого гена в отдельных тканях с помощью ПЦР в реальном времени с обратной транскрипцией и нормализуйте уровни РНК относительно 16 s рибосомальной РНК клеща. Используя метод GeneNorm, постройте кривые диссоциации в конце реакции, чтобы убедиться, что образуется только один ампликон и что ампликоны стабильно денатурируют в одном и том же температурном диапазоне для каждого образца; сравните нормализованные значения CT для уровней мРНК между клещами, которым вводили контрольный раствор, и клещами, которым вводили двухцепочечную РНК, используя t-критерий Стьюдента.

Описанный здесь протокол использовался в нашей лаборатории для проведения РНК-интерференции (RNAi) у многих различных видов клещей. Количество двухцепочечной РНК, вводимой в клещей, варьируется в зависимости от их размера. Виды клещей большего размера позволяют вводить больший объем.

Список литературы доступен в сопровождающей текстовой части протокола. При правильном выполнении протокола смертность в результате процедуры инъекции через 24 часа должна составлять менее 5%. Здесь представлен типичный фенотип клещей после нокдауна генов; группе клещей вводили пулы двухцепочечной РНК, которые использовались для скрининга защитных антигенов клещей.

При исследовании клещей с помощью световой микроскопии может наблюдаться клеточная дегенерация в тканях клеща. Фенотипические изменения также могут сопровождаться потерей функций. Например, РНК-интерференция SUBIN приводит к стерильности самцов, которые не могут успешно спариваться с самками после проведения РНК-интерференции у клещей.

Для определения влияния сайленсинга генов на экспрессию генов и белков, а также на биологию клещей могут быть использованы другие методы, включая R-T-P-C-R в реальном времени, световую, электронную или конфокальную микроскопию, геномику или протеомику. РНК-интерференция также может быть осуществлена в культурах клеток клещей, что обеспечивает метод in vitro для изучения взаимодействий между клетками клеща и патогенами.