Мутагенеза и функциональные Выбор протоколов для направленной эволюции белков в Е. палочки

Общая цель данной процедуры заключается в создании библиотеки случайных мутантов для заданной целевой последовательности ДНК, а также в быстром выявлении и характеристике мутантов с помощью полуколичетивного функционального селекционного анализа. Это достигается путем первоначальной трансформации штамма-мутатора плазмидой с одним началом репликации для coli, содержащей целевую последовательность. После посева и инкубации клеток в течение ночи они собираются, и целевая плазмида изолируется для получения библиотеки мутантов; затем эта библиотека мутантов трансформируется в считывающий штамм для характеристики мутаций во второй части протокола. Создается градиентный планшет для роста, и бактериальные культуры считывающего штамма загружаются в отдельную чашку Петри, содержащую мягкий агар.

Заключительным этапом процедуры является перенос этих бактериальных культур на градиент методом штампового переноса. В конечном итоге можно получить результаты, демонстрирующие изменения фенотипического профиля данной целевой последовательности через различия в росте на градиенте лекарственного препарата. В данном видео представлен метод направленной эволюции белков в e coli.

Этот процесс имитирует естественную эволюцию при создании библиотек случайных питательных веществ с последующим отбором, который ограничивает это разнообразие. Таким образом, это расширяет наши возможности по созданию новых биохимических активностей для промышленных или биомедицинских целей. Данная процедура состоит из двух компонентов: создания библиотеки случайных мутантов и функционального отбора для получения мутаций с приобретением функции; эту процедуру продемонстрирует Дженнифер Аллен, техник моей лаборатории.

Перед началом данного протокола подготовьте электрокомпетентные клетки JS 200, экспрессирующие низкоточный вариант ДНК-полимеразы I (low fidelity pol I), предварительно приготовленные согласно письменному протоколу; эти клетки содержат термочувствительный аллель pol I, благодаря чему активность низкоточной pol I преобладает при 37 °C. Сконструируйте целевую плазмиду, содержащую ориджин репликации coli 1, при этом целевая последовательность должна быть клонирована рядом с ориджином репликации; низкоточная pol I инициирует репликацию плазмиды coli 1, тем самым внося мутации для запуска мутагенеза.

Смешайте 40 µL электрокомпетентных клеток и от 30 до 250 ng целевой плазмидной ДНК в кювете с зазором 2 mm. Проведите электропорацию смеси в электропораторе при напряжении 1800 V. Проверьте постоянную времени (TC), чтобы обеспечить единообразие условий для каждого образца.

В идеале TC должно составлять от пяти до шести миллисекунд. Позвольте смеси ДНК и клеток восстановиться в 1 мл бульона LB в течение 40 минут при 37 °C и встряхивании при 250 RPM. Возьмите чашку Петри с LV agro диаметром 100 мм, предварительно прогретую до 37 °C и содержащую соответствующие антибиотики для селекции обеих плазмид; высейте восстановившиеся клетки в подходящем разведении, чтобы получить концентрацию, близкую к сплошному газону, что определяется как отчетливое, но не поддающееся подсчету количество колоний, как показано на данном примере.

После инкубации в течение ночи соберите бактериальные колонии из чашек Петри с помощью бульона LB. Выделите плазмидную ДНК из собранных клеток; полученная плазмидная ДНК представляет собой библиотеку случайных мутантов.

Проведите рестрикционный анализ, расщепив библиотеку плазмид рестриктационной эндонуклеазой, которая линеаризует как целевую плазмиду, так и полярную плазмиду. Для одной плазмиды проведите аналитический электрофорез в агарозном геле выделенной плазмидной ДНК, чтобы подтвердить ее качество и количество. После проверки плазмид расщепите один микрограмм библиотеки рестриктационной эндонуклеазой, которая линеаризует полярную плазмиду, но не расщепляет целевую плазмиду.

После завершения рестрикции очистите библиотеку с помощью набора для очистки ДНК. В завершение трансформируйте очищенную библиотеку в штамм для считывания, чтобы охарактеризовать мутации. Для начала подготовки градиента отметьте 10 дорожек, равномерно распределенных вдоль одного края дна квадратной чашки Петри.

Поместите чашку под наклоном так, чтобы нижний отмеченный край был приподнят на семь миллиметров. Налейте в наклонную чашку 25 миллилитров теплого LB-агара, тщательно перемешанного с соответствующей концентрацией селективного агента. Это будет нижний слой градиента.

Убедитесь, что LB-агар распределен по чашке Петри таким образом, чтобы в приподнятой маркированной части находилось примерно один миллиметр LB-агара, а в пониженной части — около восьми миллиметров. Накройте чашку крышкой KU для вентиляции и дайте агару застыть в течение 10–15 минут. После затвердевания нижнего слоя LB-агара перенесите чашку на плоскую поверхность.

Затем налейте 25 миллилитров теплого LB-агара без селективного агента поверх первой поверхности агара, стараясь полностью покрыть нижний слой. Закройте чашку крышкой для вентиляции, а затем дайте агару застыть в течение 10–15 минут перед проведением штампового переноса бактерий. Сначала получите бактериальные культуры считывающего штамма и разведите их до достижения одинаковой плотности клеток с оптической плотностью при 600 нанометрах менее 1,0.

Затем перенесите два миллилитра жидкого мягкого агара, доведенного до 42 °C, на дно круглой чашки Петри диаметром 100 мм, добавьте пипеткой 40 µL бактериальной культуры в мягкий агар и перемешайте, покачивая чашку. Нанесите смесь мягкого агара на длинный край стеклянного предметного стекла. Затем совместите покрытый край стекла с нижней меткой на чашке для создания градиента.

Прикоснитесь предметным стеклом к поверхности агара. Легкого касания достаточно, чтобы перенести полоску мягкого агара на поверхность градиента. Затем предметное стекло откладывают для очистки и повторного использования.

Повторите этот процесс. Остальные образцы и экспериментальный контроль должны быть размещены на каждой чашке с градиентом. При использовании нескольких градиентов инкубируйте чашки с градиентом в перевернутом виде в течение ночи при 37 °C; время и температура инкубации могут варьироваться для разных считывающих бактериальных штаммов, но инкубации в течение ночи при 37 °C обычно достаточно для видимого роста.

Наконец, проведите визуализацию и анализ роста клеток, как описано в письменном протоколе. Здесь представлены изображения считывающего штамма, трансформированного либо немутировавшим P-G-F-U-V, либо библиотекой мутантов PG FPUV, прошедших четыре раунда мутагенеза; темные или тусклые колонии указывают на плазмиды, содержащие инактивирующие мутации GFP.

На этом рисунке представлена частота мутаций по всей нейтральной последовательности целевой плазмиды с интервалом в 100 пар оснований. Обратите внимание, что мутации происходят во всей последовательности плазмиды, но с наибольшей частотой в области, ближайшей к точке начала репликации. Здесь показан рост мутантов в градиенте препарата.

Расстояние роста вверх по градиенту указывает на различный профиль лекарственной устойчивости мутантов. В данном примере с помощью градиентов селекции препаратов были проведены скрининг плазмидных библиотек человеческой окислительной деметилазы ABH2 на наличие мутантов с повышенной устойчивостью к метилметансульфонату. Сравнение таких библиотек, представляющих две и четыре итерации протокола мутагенеза, приведено относительно родительского дикого типа и пустого вектора.

Белая линия обозначает порог, выше которого были изолированы отдельные мутантные колонии. Для дальнейшего фенотипического анализа бета-лактамазные мутанты R 1 64 H и E 1 0 4 KR 1 64 HG 2 67 R, ранее идентифицированные с помощью низкоточного P one мутагенеза и отбора astri и m, показаны на градиенте цефотаксима 0.4 µg/mL и 4 µg/mL. Защита от цефотаксима указывает на активность бета-лактамаз расширенного спектра.

Обратите внимание, что фермент бета-лактамаза дикого типа не обеспечивает защиты по сравнению с клетками, экспрессирующими пустой вектор. Следовательно, данные мутанты представляют собой адаптацию или эволюцию новой биохимической активности. В данной работе мы представили эффективное сочетание мутагенеза и функционального отбора для создания таких новых биохимических активностей.

Функциональный отбор может быть осуществлен либо с помощью лекарственного отбора, либо посредством генетической комплементации, что позволяет использовать нашу способность создавать широкое генетическое разнообразие. Для оптимизации уже существующих активностей белков или для сайт-направленного мутагенеза может потребоваться ограничение мутагенеза определенной последовательностью. Это легко реализуется с помощью клонирования.

Кроме того, мутагенез можно отделить от функционального селективного отбора для получения сигнатурных атак или мутационных отпечатков.