Сопоставление бактериальных функциональных сетей и путей в

Целью данной процедуры является исследование функциональных связей между бактериальными генами и метаболическими путями. Это достигается путем предварительной подготовки массивов штаммов *E. coli* с одиночными мутациями, которые будут подвергнуты конъюгации или скрещиванию. Вторым этапом является конъюгация одиночных мутантов в формате массива на чашках.

Затем проводят отбор двойных мутантов. Заключительным этапом является получение изображений планшетов с двойными мутантами и квантификация колоний двойных мутантов для определения жизнеспособности штаммов. В итоге данные о размере колоний анализируются для расчета показателей генетического взаимодействия и выявления функционально взаимодействующих генов, путей и процессов.

Главным преимуществом данного метода перед существующими подходами, такими как случайный мутагенез, является возможность создания множества индивидуальных штаммов с двойными мутациями. Более того, можно одновременно оценивать взаимодействия между многими генами независимо от размера гена, его жизненно важности или жизнеспособности штамма с одиночной мутацией. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы системной биологии, в частности, касающиеся функций генов и функционального взаимодействия между путями и процессами.

Значимость данного метода распространяется на терапию бактериальных инфекций, так как сведения о большинстве функционально центральных генов и процессов, а также понимание того, какие комбинации бактериальных генов, путей и процессов при нарушении улучшают или снижают жизнеспособность бактерий, помогут разработать наиболее эффективные стратегии вмешательства. Для начала данного протокола используется двухэтапная вложенная ПЦР-амплификация для замены целевой открытой рамки считывания маркером устойчивости к хлорамфениколу из плазмиды PKD3, как описано в письменной процедуре.

Подтвердите получение ожидаемого продукта и очистите полученный фрагмент методом ПЦР согласно протоколу производителя. После элюции продукта ПЦР в 30 µL стерильной дистиллированной воды разведите его до концентрации приблизительно 50 mg/µL. Очищенный продукт хранят при температуре -20 °C до проведения трансформации.

Затем подготовьте компетентные клетки штамма HFR Caval с высокой частотой рекомбинации для конструирования донора. Сначала инокулируйте один миллилитр насыщенной ночной культуры штамма HFR Cavalli в 70 миллилитров свежей среды LB с добавлением 35 мкл ампициллина в концентрации 50 мг/мл в колбе объемом 250 миллилитров.

Инкубируйте культуру при 32 °C, осторожно перемешивая при 220 RPM, до достижения оптической плотности примерно 0,5–0,6. Затем перенесите культуру в водяную баню для тепловой индукции системы рекомбинации Lambda Red при 42 °C в течение 15 минут с перемешиванием при 160 RPM, после чего прекратите индукцию. Перенесите культуру в охлажденную водяную баню со смесью льда и воды на 10–20 минут при 160 RPM.

Следите за тем, чтобы клетки оставались холодными до завершения трансформации. После промывки и сбора клеток путем центрифугирования, как описано в письменном протоколе, слейте супернатант и ресуспендируйте осадок в 500 µL ледяного 10% глицеринового раствора Eloqua. Разлейте клетки объемами по 50 µL в отдельные предварительно охлажденные микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 мл и немедленно приступайте к трансформации.

Добавьте 100 nanograms очищенной кассеты делеции гена в компетентные клетки. Слегка встряхните пробирку и выдержите суспензию на льду в течение пяти минут. Затем перенесите суспензию в предварительно охлажденную кювету для электропорации и немедленно проведите электропорацию смеси клеток.

Добавьте 1 ml среды SOC комнатной температуры и перенесите электропорированные клетки в среде в культуральную пробирку объемом 15 ml. Инкубируйте клетки при 32 °C в течение одного часа при орбитальном встряхивании со скоростью 220 RPM. После инкубации центрифугируйте клетки при 4 400 ×g в течение пяти минут.

При комнатной температуре удалите примерно 850 µL супернатанта и ресуспендируйте клеточный осадок в оставшейся жидкости. Рассейте клетки по чашкам с LB-средой, содержащей 17 µg/mL хлорамфеникола, и инкубируйте при 32 °C в течение ночи. На следующий день проведите пересев двух отдельных трансформантов на чашки с LB-средой и хлорамфениколом для подтверждения мутации; также проведите пересев этих же трансформантов на чашки с LB-средой и канамицином, чтобы подтвердить отсутствие у штаммов устойчивости к канамицину.

Затем ДНК амплифицируют с использованием трех различных наборов праймеров для подтверждения нокаута, как описано в письменном протоколе. Первый набор праймеров состоит из прямого фланкирующего праймера длиной 20 нуклеотидов, расположенного на 200 пар оснований выше целевого участка, и обратного праймера, комплементарного кассете устойчивости к хлорамфениколу. В результате этой амплификации ожидается получение ампликона длиной 445 нуклеотидов.

Второй набор включает прямой праймер, комплементарный последовательности кассеты устойчивости к хлорамфениколу, и обратный фланкирующий подтверждающий праймер, который разработан для отжига на расстоянии 200 пар оснований ниже 3'-конца делетированного гена. Ожидается, что эта реакция амплификации приведет к образованию ампликона размером 309 нуклеотидов. Третья ПЦР включает как вышележащие, так и нижележащие фланкирующие праймеры.

Эта реакция необходима для подтверждения того, что выбранный штамм не является диплоидом с дупликацией, при которой один генный локус был заменен кассетой, а другая копия гена дикого типа сохранилась. Ожидается, что в результате этой амплификации получится продукт размером 1.4 KB. Коллекция мутантов E. coli с делециями одиночных неessential генов была роботизированным способом реплицирована на 24 384 чашки.

Заполните микропланшет средой LB по 80 µL на лунку. Добавьте канамицин в концентрации 50 µg/mL. Оставьте место для бортового контрольного штамма, который используется в качестве положительного контроля и помогает в нормализации планшета, а также в автоматизированном количественном определении колоний. Удалите инокулированную среду из крайних лунок каждого планшета и перенесите её в новые планшеты, оставив крайние лунки пустыми.

Аналогично создайте пятна отрицательного контроля, удалив любые два штамма из другого места на каждой пластине и перенеся штаммы на новую пластину. Затем заполните пустые лунки, включая пограничные контрольные лунки и лунки отрицательного контроля, средой LV, содержащей 17 µg/mL хлорамфеникола. Ожидается, что эти пятна отрицательного контроля будут пустыми в реципиенте и, следовательно, на пластинах с двойными мутантами.

Они служат для того, чтобы убедиться в отсутствии ошибок при обработке или перемещении планшетов во время нумерации снимков или расстановки образцов по лункам. После подготовки граничного положительного штамма, как описано в письменной процедуре, массивы штаммов, а также граничный положительный штамм выращивают в течение ночи при 32 °C с орбитальным встряхиванием при 190 RPM; на следующий день заполняют граничные лунки примерно 80 µL ночной культуры. Собранные планшеты можно использовать для скрещивания, как описано в следующем разделе.

В качестве альтернативы для длительного хранения в каждую лунку планшетов-реципиентов добавляют 15% глицерина, после чего среду и глицерин перемешивают. Затем планшеты хранят при температуре -80 °C. Процедуру скрещивания начинают с нарастания донорского штамма HFR, содержащего делецию искомого гена, отмеченную кассетой устойчивости к хлорамфениколу; культивирование проводят в течение ночи при 32 °C в богатой жидкой среде LB с добавлением 17 µg/mL хлорамфеникола.

Коллекцию мутантных штаммов-реципиентов TH высеяли в формате 384 колонии на плотные среды LB, дополненные 50 µg/mL канамицина. Параллельно штамм мутанта-донора высеяли в формате 384 колонии на такое же количество чашек с LB.

Добавьте хлорамфеникол в концентрации 17 µg/mL. Инкубируйте чашки в течение ночи при 32 °C для конъюгации штаммов. Перенесите доноры из ночных чашек с 3 84 колониями доноров на твердый LB-агар.

Затем в течение ночи перенесите штаммы с одной реципиентной пластины с 384 колониями поверх свежеперенесенных доноров. Инкубируйте пластины для конъюгации при 32 °C от 16 до 24 часов. Затем перенесите содержимое каждой пластины для конъюгации с плотностью 384 на одну плотную среду LB с хлорамфениколом.

Повторяйте этот процесс до тех пор, пока все чашки с конъюгацией не будут перенесены. Инкубируйте свежеподготовленные первые селекционные чашки от 16 до 36 часов при 32 °C. После инкубации перенесите колонии с каждой первой селекционной чашки на вторую чашку с двойным лекарственным отбором в формате 1536 SPOT таким образом, чтобы каждая колония с первой селекционной чашки была представлена четырьмя колониями.

Инкубируйте чашки на второй селективной среде в течение 16–36 часов при 32 °C, после чего сфотографируйте конечные селективные чашки с двойными мутантами для количественной оценки приспособленности мутантов к росту и анализа взаимодействий между парами генов. Поскольку гены одного и того же пути демонстрируют тесно коррелирующие паттерны GI, функционально связанные гены можно сгруппировать путем их кластеризации в соответствии с общей схожестью профилей S-показателя.

Сходство профилей GI представляет собой конгруэнтность фенотипов при мутации двух генов и должно указывать на то, действуют ли эти два гена в одном или перекрывающихся путях. Здесь показано распределение коэффициентов корреляции между профилями GI пар генов, кодирующих физически взаимодействующие белки, по сравнению со случайно выбранными парами генов. Пример диаграммы рассеяния коррелирующих генетических профилей для двух транспортеров, которые образуют гетеротримерный комплекс, необходимый для экскреции спермы, показан на примере гена ecoline дрожжей.

Смягчающие взаимодействия с высококоррелированными профилями ГИ, как правило, кодируют пути, которые физически связаны или согласованно действуют в общем биохимическом пути. Здесь представлен репрезентативный пример, в котором компоненты функционально избыточных путей биосинтеза железосерных кластеров ISC и SUF, совместно участвующих в жизненно важном процессе, образуют отдельные кластеры, которые связаны между собой многочисленными отягощающими взаимодействиями. Статистический критерий может быть использован для поиска любого значимого обогащения взаимодействий между конкретными комбинациями путей, интеграции сетей ГИ с физическими взаимодействиями и другими данными о функциональных ассоциациях, такими как геномный контекст.

Взаимосвязи могут раскрыть организацию функциональных модулей более высокого порядка, которые определяют основные биологические системы бактерий. Кластерный анализ также может быть применен к сетям генных взаимодействий (GI) для предсказания функций аннотированных генов. Поскольку алгоритмы кластеризации различаются.

Однако предполагаемые функциональные назначения, определенные с помощью кластеризации, требуют независимого экспериментального подтверждения. При выполнении этой процедуры важно не забыть включить все необходимые положительные и отрицательные контроли. Для получения ответов на дополнительные вопросы о функциях конкретных генов, а также о характере функциональных связей между генами и метаболическими путями могут быть использованы другие методы, такие как протеомика, последующие биохимические эксперименты и химическая геномика.

После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как конструировать штаммы с двойными мутациями, собирать реципиентные массивы и проводить скрининги ESGA для исследования функциональных взаимосвязей между генами и процессами в e coli.