Дрожжи колонии Вложение Метод

Общая цель данной процедуры — инкапсуляция колоний дрожжей. Для этого сначала извлекают колонию вместе с подлежащим слоем агара с чашки Петри, помещают ее на несколько капель расплавленного агара и быстро заливают дополнительным слоем расплавленного агара. Затем излишки агара удаляют вокруг колонии, чтобы ее размер соответствовал размеру формы.

Затем фиксируют встроенную колонию AER, окрашивают, обезвоживают и, наконец, заливают смолой Spurs. Блок помещают в форму с дополнительной смолой Spurs, инкубируют до затвердевания, после чего делают срезы. В итоге можно получить результаты, демонстрирующие распределение типов клеток внутри колонии дрожжей с помощью световой или электронной микроскопии.

Основным преимуществом данного метода перед существующими, такими как сканирующая электронная микроскопия, является возможность определения внутренней структуры колонии. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области развития микроорганизмов, например, о распределении типов клеток внутри колоний. Данный метод позволил изучить структуру колоний croce CAC, однако, вероятно, он может быть применен и к другим микроорганизмам.

Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение, так как правила обращения с колониями и их помещение в блок сложно освоить только по письменному протоколу. Идея этого метода была вдохновлена опубликованными нами в 2002 году генетическими данными, которые свидетельствовали о неравномерном распределении спор в колониях. Мы адаптировали метод секционирования колоний, разработанный Engelberg в лаборатории Fin.

Итак, приступим. Начните с инкубации дрожжей Wild S visi на чашках с агаром при 30 °C до появления примерно 300 колоний. С помощью узкого шпателя поочередно снимайте с чашки колонии диаметром от одного до двух миллиметров.

Затем с помощью наконечника дозатора на 1 мл нанесите несколько капель 2% агара при 42 °C на предметное стекло и немедленно поместите колонию агаром вверх до того, как AER затвердеет. Нанесите еще несколько капель агара на колонию и дайте агару затвердеть, убедившись, что вся колония, включая ее верхнюю часть, полностью заключена в агар. На всех последующих этапах протокола используйте лезвие бритвы.

Обрежьте AER вокруг колонии и поместите блок AER, содержащий колонию, в стеклянный виал с завинчивающейся крышкой объемом 3,5 миллилитра, содержащий фиксатор из 2% параформальдегида и 2% глутаральдегида. Колонии следует обрабатывать по одной, чтобы предотвратить высыхание, однако в один виал можно поместить до 10 колоний. Оставьте колонии на семь дней при температуре четыре градуса Цельсия.

Через одну неделю удалите фиксатор и дважды промойте колонии agri, используя примерно 1.5 milliliters 0.15 molar sodium cate при pH 7.2, инкубируя на льду в течение 15 минут без перемешивания после каждой промывки. После этого повторите промывку еще дважды.

Используйте 1,5 мл 1X буфера OS, состоящего из 100 мМ монофосфата калия и 10 мМ хлорида магния при pH 6,0; после каждой промывки выдерживайте на льду в течение пяти минут. Затем, используя ту же пробирку, проведите обработку осмием и промывки, описанные здесь и в текстовой части данного протокола. После этого, снова используя ту же пробирку, ранним утром следующего дня выполните поэтапную дегидратацию, указанную здесь и в сопроводительном письменном протоколе.

Приготовьте реагент для шпор, как показано здесь и в прилагаемом письменном протоколе. Немедленно промойте agri-блоки пять раз по 10 минут каждый, используя 1.5 milliliters 100% этанола комнатной температуры. После последнего промывания этанолом удалите лишь столько этанола, чтобы agri-блок оставался покрытым.

С помощью пастуральной пипетки внесите примерно 0.5 milliliters реагента spurs в флакон и перемешивайте на роторе при низкой скорости в течение 15 минут. После перемешивания выдержите флакон при комнатной температуре в течение 30 минут. Затем полностью удалите раствор.

Затем добавьте 1,5 мл реагента spurs, чтобы полностью покрыть блок agri. Снова вращайте флакон на роторе в течение 15 минут при комнатной температуре, после чего оставьте его на 30 минут. Повторите эту процедуру промывки.

Повторите процедуру еще три раза. По истечении последних 30 минут удалите реагент SPURS и добавьте свежий реагент SPURS, чтобы полностью покрыть блоки. Оставьте агри-блоки при комнатной температуре на четыре часа.

Замените реагент для создания выступов (spurs) и оставьте пробирки вращаться на ночь. На следующее утро снова замените реагент для создания выступов и продолжайте вращение до следующего дня. На следующее утро налейте реагент для создания выступов в пронумерованные силиконовые формы так, чтобы он лишь покрывал дно форм.

Затем поместите агри-блоки в формы и инкубируйте при 60 °C в течение четырех часов. Через четыре часа долейте в формы дополнительные шпорцы и реагент, после чего инкубируйте при 60 °C в течение ночи. Извлеките блоки из форм для дальнейшего срезания.

Здесь представлен пример микрофотографии среза через центр колонии дрожжей дикого типа Visia. Эти дрожжи представляют собой штамм дикого типа, выделенный из экссудатов деревьев. Перед созданием среза колония инкубировалась в течение шести дней на среде YNA.

На данном изображении легко различимы аsai, псевдогифы и овоидные дрожжи, а также видна область колонии, проникающая в нижележащий агар. Открытые стрелки указывают на типичные аsai, закрашенные стрелки — на типичные овоидные вегетативные клетки, закрашенные наконечники стрелок — на цепочки удлиненных клеток и si. Это изображение является примером электронной микрофотографии тонкого среза лабораторного штамма дрожжей SH 1 0 2 0 и W 3 0 3.Фон.

Перед приготовлением срезов колонию инкубировали в течение шести дней на среде YNA. На изображении показан участок колонии с высокой частотой спорулированных клеток. Стрелкой indicated двухслойная структура стенки споры.

В части A показан срез четырехдневной колонии с наложенной на изображение из части B сеткой, состоящей из 15 прямоугольников. Частота клеток, связанных со спорами, в каждом прямоугольнике представлена графиком из 15 столбцов, соответствующих 15 прямоугольникам, показанным в части A. Данные представляют собой среднее значение и стандартную ошибку для четырех независимых четырехдневных колоний. В части C показаны средние значения и стандартные ошибки для четырех независимых восьмидневных колоний. После освоения эта методика может быть выполнена за две недели, включая один полный рабочий день и несколько дней по один-три часа. При выполнении данной процедуры важно помнить о необходимости немедленного добавления растворов, чтобы блоки не пересохли в ходе выполнения данной процедуры.

Для определения распределения клеток, экспрессирующих определенные белки после их развития, можно использовать и другие методы, такие как иммуноэлектронная микроскопия. Данный метод позволил нам изучить не только закономерности расположения спорулирующих клеток, но и паттерны псевдогифальных клеток в колониях croce CCI. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как проводить заливку колоний дрожжей для последующего сечения.

Не забывайте, что многие реагенты для микроскопии, используемые в данном протоколе, могут быть крайне опасными. Пожалуйста, не забывайте использовать вытяжной шкаф, носить защитную одежду и надлежащим образом утилизировать реагенты. На этом все.

Спасибо за просмотр. Удачи в ваших экспериментах.