Быстрая Техника для визуализации живых иммобилизованных клеток дрожжей
9 ноября 2006 г.
Быстрый метод для визуализации растущего иммобилизованных клеток дрожжей, здесь применяется к флуоресцентным журналистам на молчание спаривания локусов HML и HMR
Целью данного эксперимента является наблюдение за популяцией клеток в микроскопе для того, чтобы проследить, как изменяются эпигенетические состояния и как часто они меняются с каждым последующим делением клеток. Возьмите длинное покровное стекло, нанесите на него около 7 µL клеток, используя чашку с синтетической питательной средой. С помощью лезвия бритвы сделайте надрезы в агаре. Вырежьте блок агара, поднимите его и поместите поверх клеток.
Хорошо, для краткосрочных экспериментов продолжительностью до трех часов этого достаточно. Для более длительных экспериментов клетки будут иммобилизованы: я добавляю жидкую среду поверх агарозной подушечки, а затем накрываю всю конструкцию предметным стеклом.
Среда будет служить своего рода герметиком между ними. Предметное стекло предназначено исключительно для предотвращения испарения с верхней поверхности блока агара. При такой установке блок агара будет оставаться увлажненным, и клетки будут продолжать делиться в течение минимум восьми часов.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данной статье представлена методика экспресс-визуализации иммобилизованных клеток дрожжей, основанная на использовании флуоресцентных репортеров в сайленсированных локусах спаривания HML и HMR. Этот метод позволяет наблюдать за изменениями эпигенетического состояния в процессе деления клеток.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Биология клетки
- Эпигенетика
- Физиология микроорганизмов
Теоретическая часть
- Понимание эпигенетических изменений в клетках дрожжей имеет решающее значение для изучения клеточного поведения.
- Флуоресцентные репортеры позволяют эффективно визуализировать генетические локусы.
- Методы иммобилизации необходимы для длительного наблюдения под микроскопом.
- Дрожжи служат модельным организмом для изучения генетических и эпигенетических процессов.
Цель исследования
- Визуализация роста и деления иммобилизованных дрожжевых клеток.
- Мониторинг изменений эпигенетических состояний в процессе деления клеток.
- Разработка метода, облегчающего проведение краткосрочных и долгосрочных экспериментов.
Используемые методы
- Подготовка удлиненного покровного стекла с определенным объемом клеток дрожжей.
- Использование чашек с синтетической средой для выращивания клеток.
- Иммобилизация клеток с помощью агаровых блоков для последующего наблюдения.
- Применение жидкой среды для проведения длительных экспериментов.
Основные результаты
- Успешная визуализация роста и деления клеток дрожжей.
- Наблюдение за изменениями эпигенетического состояния в ходе последовательных делений.
- Демонстрация эффективности метода иммобилизации.
- Понимание динамики эпигенетических изменений у дрожжей.
Выводы
- Данный метод представляет собой надежный способ изучения поведения клеток дрожжей.
- Флуоресцентные репортеры эффективны для мониторинга генетических локусов.
- Этот подход позволяет углубить понимание эпигенетической регуляции в клетках.
Часто задаваемые вопросы
Значимость для промышленности
Данный метод обеспечивает визуализацию эпигенетической динамики у дрожжей в режиме реального времени, что способствует валидации мишеней при поиске эпигенетических лекарственных средств. Путем отслеживания стохастических изменений состояния в сайленсированных локусах спаривания метод позволяет получить количественные данные для механистического снижения рисков при разработке соединений, модифицирующих хроматин. Совместимость метода с таймлапс-микроскопией продолжительностью до десяти часов позволяет оценить эпигенетическую стабильность в ряду поколений, что повышает прогностическую достоверность доклинических моделей.
Стратегическое применение в исследованиях и разработках биофармацевтики
Ранний поиск и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет исследовать механизмы эпигенетического наследования в определенных генетических локусах.
- Практическая ценность: предоставляет гибкую платформу для валидации мишеней, участвующих в сайленсинге хроматина.
- Прогностическая ценность: позволяет оценивать влияние модуляции мишеней на частоту переключения эпигенетических состояний.
Скрининг и разработка анализа
- Готовность анализа: создание иммобилизованных популяций дрожжей, пригодных для скрининга соединений с использованием флуоресцентного считывания.
- Количественный выход: позволяет измерять скорость эпигенетического переключения в качестве функциональной конечной точки анализа.
- Масштабируемость: совместимость с многолуночными форматами за счет иммобилизации на агариковых подушечках для параллельного тестирования различных условий.
Трансляционные и доклинические исследования
- Значимость для изучения заболеваний: Моделирует эпигенетическую нестабильность, наблюдаемую при раке и нарушениях развития.
- Трансляционная преемственность: Связывает эпигенетические механизмы дрожжей с путями регуляции хроматина млекопитающих.
- Оптимизация рисков при разработке: Позволяет на ранних этапах снизить риски при выборе эпигенетических мишеней путем количественной оценки стабильности состояния.
Интеграция конвейера и рабочего процесса
Данный метод подходит для рабочих процессов на ранних этапах поиска новых лекарственных средств, когда валидация эпигенетических мишеней требует прямого наблюдения за изменениями состояния в живых клетках.
- Фундаментальная биология: упрощает проверку гипотез об эпигенетических регуляторах посредством визуализации локусов в режиме реального времени.
- Скрининг: позволяет получать стандартизированные, воспроизводимые клеточные препараты для скрининга библиотек соединений.
- Аналитика: обеспечивает получение количественных данных о частоте переключения для сравнения влияния соединений на эпигенетическую стабильность.
- Трансляционные исследования: связывает механизмы сайленсинга у дрожжей с регуляцией хроматина более высокого порядка в моделях заболеваний.
- Практическое применение: создает многоразовую платформу иммобилизации для работы с различными эпигенетическими мишенями и проведения исследований с временным анализом.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Снижает механистическую неопределенность при валидации эпигенетических мишеней за счет прямого наблюдения.
- Операционная ценность: Обеспечивает воспроизводимость благодаря стандартизированной иммобилизации на агариковых подушечках и герметизации жидкой среды.
- Стратегическая ценность: Улучшает принятие решений о целесообразности дальнейшей разработки (go/no-go) путем количественной оценки эпигенетического шума и эффектов модуляции мишеней.
- Влияние на портфель: Поддерживает приоритезацию эпигенетических модификаторов с учетом рисков на основе данных о частоте переключения.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы в области генетики дрожжей и флуоресцентной микроскопии.
- Зависит от наличия синтетических сред и агарозы для приготовления подушек.
- Требуется стандартизация плотности клеток и размеров агаровых блоков во всех экспериментах.
- Подразумевает необходимость адаптации под различные штаммы дрожжей и системы флуоресцентных репортеров.
- Ограничено контролем испарения в установках без перекрытия жидкой средой при длительных запусках.
