Генотипическая вывода ВИЧ-1 тропизм Использование Популяционные Секвенирование V3

Общая цель данной процедуры заключается в определении вирусного тропизма у пациента с ВИЧ-инфекцией путем секвенирования области V3 гена вирусной оболочки. Сначала из плазмы крови пациента экстрагируют ВИЧ-РНК. Затем с помощью вложенной ОТ-ПЦР амплифицируют область V3 белка GP120 ВИЧ. После этого наличие продукта подтверждают методом гель-электрофореза с последующим популяционным секвенированием амплифицированных продуктов области V3.

В завершение проанализируйте последовательности с помощью программного обеспечения для определения оснований (base calling) и определите использование ко-рецепторов с помощью алгоритма genome to pheno. В конечном итоге эти результаты позволяют установить, является ли вирусный тропизм пациента R5 или не-R5, путем популяционного секвенирования петли V3 ВИЧ. Таким образом, основным преимуществом данного метода анализа тропизма по сравнению с существующими методами, такими как фенотипические анализы на основе клеток, является возможность его проведения в любой лаборатории, оснащенной оборудованием для секвенирования, при меньших затратах, за более короткое время и с меньшим количеством исходного материала.

Данный метод актуален для лечения антиретровирусной терапией, поскольку он позволяет определить по 500 µL плазмы, будет ли вирусная популяция пациента, вероятно, реагировать на антагонист CCR5. Используйте автоматический экстрактор EasyMag для выделения HIV RNA. Затем перейдите в чистое помещение для ПЦР, чтобы подготовить RT-PCR и обеспечить адекватный отбор проб вирусной популяции.

Предусмотрите проведение каждой реакции обратной транскрипции в трех повторностях в рамках этой одностадийной реакции. Используйте вирусную РНК для синтеза кДНК, обеспечивая специфическую амплификацию области HIVV three с помощью праймеров SQV three F1 и CO 6 0 2 prime repair. Исходите из компонентов на одну реакцию.

Приготовьте основной рабочий раствор в объеме, достаточном для количества амплифицируемых образцов, используя репетерную пипетку. Добавьте 36 µL смеси для образцов в каждую лунку ПЦР-планшета. Затем перейдите на многоканальный дозатор, чтобы перенести соответствующий объем экстракта РНК в каждую из назначенных лунок. Обязательно меняйте наконечники после каждого добавления.

После завершения переноса закройте лунки стрип-крышками для ПЦР. Затем поместите ПЦР-планшет в амплификатор, программу которого настройте на одностадийную ОТРЦР региона HIVV three. Для вложенной ПЦР используйте праймеры SQV three F two и CD four R.

Рассчитайте количество реагентов, необходимых для определенного числа образцов, которые будут амплифицированы в чистом помещении для ПЦР. Приготовьте смесь для вложенной ПЦР, а затем с помощью многоканального дозатора внесите по 19 µL в каждую лунку чистого ПЦР-планшета. По завершении RT-PCR переместитесь в помещение для постоперационной обработки (после амплификации).

С помощью восьмиканального многоканального дозатора перенесите 1 µL матрицы для РТ-ПЦР в смесь для гнездовой ПЦР. Меняйте наконечники после каждого добавления. Закройте лунки стрипами для ПЦР и поместите планшет в термоциклер для амплификации.

Извлеките планшет из термоциклера после того, как температура вернется к 25 °C. Чтобы подтвердить успешную амплификацию региона V3, сначала проанализируйте продукты с помощью гель-электрофореза. Приготовьте 1,6% agarose-гель с красителем CyberSafe.

Используя многоканальный дозатор на 10 µL, перенесите по 8 µL образцов ПЦР в соответствующие лунки. Также внесите маркер молекулярного веса ДНК как минимум в одну лунку каждого ряда.

Проводите электрофорез в геле при напряжении около 100 вольт в течение 10 минут. Визуализируйте полосы с помощью ультрафиолетовой флуоресценции и зафиксируйте изображение с помощью фотографии. Отметьте образцы, в которых все три параллельных амплификации прошли успешно.

При необходимости повторите R-T-P-C-R для тех образцов, в которых было получено менее трех амплифицированных продуктов. Образцы амплифицированной вирусной кДНК дополнительно верифицируют с помощью реакций секвенирования ДНК с использованием праймеров V 3 0 2 F и S QV three R one. Извлеките реагент big di из морозильной камеры и разморозьте при комнатной температуре.

Рассчитайте и подготовьте реагенты, необходимые для планируемого количества образцов. С помощью многоканального дозатора внесите по 5 µL смеси для реакции секвенирования в соответствующие лунки планшета. Накройте планшет салфеткой Kimwipe и отставьте в сторону.

Тем временем приготовьте разведение амплифицированного ПЦР-продукта в соотношении 1:15, добавив 180 µL стерильной воды к оставшемуся ПЦР-продукту. Пипетируйте 1 µL разведенного образца на дно соответствующей лунки планшета. Всегда меняйте наконечники между образцами после завершения переноса каждого образца.

Закройте планшет стрип-крышками и перемешайте на вортексе в течение одной секунды. Для центрифугирования планшета установите скорость 140 5G. Когда скорость центрифугирования достигнет 140 5G, остановите центрифугирование.

Поместите планшет в термоциклер для проведения реакции. В каждую лунку добавьте для осаждения ДНК 4 µL 3 M ацетата натрия и 40 µL охлажденного 95% этанола, затем снова плотно закройте крышки. Перемешайте содержимое планшета на вортексе в течение 10 секунд и слегка постучите по планшету, чтобы удалить пузырьки воздуха.

Поместите планшеты при температуре -20 °C на период от 30 минут до двух часов. Выделите ДНК путем центрифугирования при 2000 G в течение 20 минут. Снимите и утилизируйте крышки стрипов.

Переверните планшет над контейнером для отходов и слейте супернатант. Удалите остатки супернатанта, промокнув перевернутые планшеты бумажным полотенцем.

Сложите два листа бумажного полотенца так, чтобы зажать планшет между ними. Поместите планшет лицевой стороной вниз в центрифугу и центрифугируйте при 140 5G. Остановите центрифугирование, когда будет достигнуто значение 140 5G.

Затем промойте 155 µL 95% этанола и слейте жидкость. После этого повторите центрифугирование. Оставьте планшет на две-пять минут, чтобы остатки этанола испарились.

Для денатурации образцов ДНК с помощью многоканального дозатора распределите по 10 µL красителя high dye for maide во все лунки планшета, включая пустые. Герметизируйте планшет септой и поместите в термоциклер при 90 °C на две минуты. Наконец, поместите планшет с образцами в секвенирующий планшет, а затем в секвенатор.

Одним из приемлемых способов анализа данных является использование программного обеспечения Recall для автоматического определения последовательности оснований (base calling) без участия человека. Recall представляет собой бесплатное специализированное ПО для определения последовательности оснований; войдите в систему и выберите файлы образцов для загрузки с помощью опции browse. Найдите файл с необработанными данными секвенирования и загрузите до 20 megabytes.

Затем установите референсную последовательность на V three. Нажмите «process data». Выберите полученную папку в правой части страницы, чтобы отобразить список образцов.

Образцы, отмеченные красным, не прошли проверку. Образцы, отмеченные зеленым, прошли проверку. Нажав на конкретный образец и кнопку просмотра, вы сможете изучить последовательность, следуя инструкциям в правой части страницы для навигации по последовательности, а также скачать файлы в zip-архиве.

Вирусный тропизм можно определить по последовательностям, полученным методом популяционного секвенирования, с использованием алгоритма сопоставления генотипа и фенотипа корецептора. В выпадающем меню значимости (significant setting) выберите вариант «оптимизировано на основе анализа клинических данных из motivate 2% и 5.75% FPR». Теперь выберите вариант загрузки или вставки последовательности для анализа.

Допускается использование файлов в формате FASTA. Не добавляйте другие данные; переходите к получению прогноза geno Tono FPRA по чувствительности к пяти антагонистам CCR5. Сгенерированный отчет G two P предоставляет последовательность петли V3 в аминокислотах и указывает соответствующие позиции мутаций, связанных с вирусами, устойчивыми к R5.

В нижней части отчета приводится уровень ложноположительных результатов, который интерпретируется с точки зрения ответа на антагонист CCR5. Этот отчет можно скачать в виде PDF-файла. Если хотя бы одна из трех последовательностей образца определяется как не-R5, пациент, скорее всего, не ответит на антагонист CCR5, как ожидалось; гель-электрофорез продуктов ОТ-ПЦР амплификации петли V3 ВИЧ-1 показывает, что не все клинические образцы дают продукт.

Полученные последовательности амплифицированных образцов можно визуализировать в виде хроматограммы, считанной с помощью программы recall. Ожидается получение чистой последовательности с минимальным количеством смесей. В некоторых случаях последовательности могут быть зашумленными, что затрудняет точное определение оснований.

У некоторых пациентов может быть выявлено наличие вируса, использующего не CCR5, как показано здесь. Такие пациенты, скорее всего, не ответят на лечение антагонистами CCR5. Однако у большинства пациентов обнаруживается вирусная популяция, состоящая из вируса, использующего CCR5, что отмечено зеленым квадратом в нижней части отчета об анализе G2P.

После освоения данная методика может быть выполнена примерно за четыре дня от начала до конца — от экстракции до анализа. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как прогнозировать вирусный тропизм, используя методы популяционного секвенирования в сочетании с биоинформатическим алгоритмом genome pheno.

На этом всё. Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.