Рестриктазой основе Клонирование метод оценки

Общая цель данной процедуры заключается во встраивании генов gag, выделенных из плазмы лиц, инфицированных HIV1 субтипа C, в репликативно компетентную плазмиду HIV1 для оценки влияния полиморфизмов последовательности gag на способность HIV1 к репликации in vitro. Это достигается путем первоначальной амплификации гена gag из плазмы пациента. Вторым этапом является клонирование полученной от пациента последовательности gag в репликативно компетентный инфекционный молекулярный клон MJ-four. Затем проводится трансфекция химерной плазмиды gag-MJ-four для создания инфекционных вирусных стоков с последующим определением титра для оценки инфекционности на индикаторной клеточной линии. Заключительный этап заключается в измерении способности к репликации in vitro в линии Т-клеток GXR-25. В конечном итоге для количественного определения продукции вирионов во времени и визуализации кинетики вирусной репликации используется радиометрический анализ обратной транскриптазы.

Метод, который мы опишем сегодня, может помочь ответить на ключевые вопросы в области изучения ВИЧ. К ним относятся определение факторов, определяющих репликативную приспособленность ВИЧ, и понимание того, как эта приспособленность влияет на долгосрочный патогенез. Методы сегодня представят Джессика Принс и Дэн Клейборн, два моих аспиранта.

Для начала данной процедуры проведите обратную транскрипцию кДНК из РНК и амплификацию продуктов первого раунда с использованием обратной транскриптазы и термостабильной ДНК-полимеразы в одноэтапной ОТ-ПЦР. Затем, используя 1 µL продуктов амплификации ПЦР первого раунда в качестве матрицы ДНК, проведите вложенную ПЦР-амплификацию второго раунда. Далее добавьте 3 µL 5X красителя для нанесения в электрофорез к 5 µL объема реакционной смеси второго раунда.

Проводите электрофорез при 120 В в 1% agarose TAE геле, содержащем УФ-флуоресцентный краситель ДНК, до разделения полос. Затем визуализируйте полосы 1.6 KB на синем illuminating-устройстве. После этого прогоните оставшийся объем реакции 45 µL в 1% agarose TAE геле, содержащем краситель ДНК. Вырежьте соответствующие полосы чистым лезвием и объедините три положительные реакции для одного индивидуума. Затем экстрагируйте ДНК из фрагмента геля с помощью набора для очистки геля и элюируйте ее в nuclease free water. Заморозьте продукт при −20 °C для последующего использования. 0:15:56 В данной процедуре после амплификации области 5' UTR длинного концевого повтора плазмиды MJ-four визуализируйте ПЦР-продукты 1.3 KB на иллюминаторе. Вырежьте положительные ампликоны, затем очистите и заморозьте их, как описано ранее. Далее создайте слитые ампликоны MJ-four LTR gag с помощью ПЦР с перекрывающимися концами (splice overlap extension PCR). Визуализируйте, вырежьте, очистите и заморозьте ампликон длиной 3.2 kb. Теперь переварите 1.5 µg плазмиды MJ-four и 1.5 µg очищенного ПЦР-продукта LTR-gag с помощью рестрикционной эндонуклеазы BCL-one в течение 1.5 часов при 50 °C. Затем добавьте 1 µL NGOM-four в реакционную смесь для переваривания и инкубируйте ее при 37 °C в течение одного часа. После этого добавьте 5x loading dye в реакции рестрикционного переваривания. Медленно проведите электрофорез всего объема в 1% agarose TAE геле, содержащем краситель ДНК, в течение одного-двух часов при 100 В. Визуализируйте, вырежьте и очистите указанные полосы для клонирования, как описано ранее.

Затем подготовьте реакции лигирования, используя очищенную вставку LTR-gag и векторную ДНК MJ-four в соотношении вставки к вектору три к одному. Инкубируйте реакции лигирования в течение ночи при температуре 4 °C.

Затем проведите трансформацию химически компетентных бактерий JM-109 продуктами лигирования, высеяв их на чашки с LB-агаром, содержащим 100 µg/mL ампициллина. Инкубируйте трансформированные бактерии при 30 °C не менее 22 часов. Чтобы подтвердить точность клонирования, проведите двойной рестрикционный анализ ДНК, выделенной методом мини-препа, с использованием ферментов NGOM-four и HPA-one при 37 °C в течение двух часов.

После этого проведите анализ на 1% агарозном геле в TAE-буфере. Рассчитайте объем вируса, необходимый из каждого стока, исходя из титра ИЕ на микролитр, полученного в ходе анализа на клетках TZM-BL, чтобы заразить 5 × 10⁵ клеток GXR-25 с множественностью заражения (MOI) 0,05. Обязательно используйте соответствующие средства индивидуальной защиты для работы с репликативно-компетентным ВИЧ, включая полный халат, лицевую маску и двойные перчатки. В день заражения извлеките стоки вируса из морозильника при -80 °C и разморозьте их. Затем разведите вирус в среде C-R-P-M-I до объема 100 µL для достижения MOI 0,05. Добавьте его в 96-луночный планшет с V-образным дном, обработанный для культивирования тканей, включив положительный и отрицательный контроли в каждую серию экспериментов по репликации; расположите образцы так, чтобы каждая вторая колонка оставалась пустой для ограничения перекрестного загрязнения между лунками. После этого подсчитайте количество клеток GXR-25 с помощью автоматического счетчика клеток и рассчитайте общее число клеток, необходимое для всех заражений. Перенесите требуемый объем в коническую пробирку объемом 50 mL и центрифугируйте для осаждения клеток. Затем осторожно аспирируйте среду и ресуспендируйте клетки в C-R-P-M-I до концентрации 5 × 10⁵ клеток на 100 µL. Перенесите клетки в стерильный желоб и тщательно перемешайте. Впоследствии, используя многоканальный дозатор, добавьте по 100 µL клеток в каждую лунку 96-луночного планшета с разведенным вирусом и тщательно перемешайте. После этого добавьте в каждую лунку 2 µL раствора полибрена в концентрации 5 mg/mL и тщательно перемешайте клетки. Затем инкубируйте при 37 °C в инкубаторе для культур тканей с 5% CO2 в течение трех часов.

Для промывки инфицированных клеток центрифугируйте 96-луночный V-образный планшет для осаждения клеток. Затем осторожно удалите 150 µL среды и замените ее свежими 150 µL C-R-P-M-I, стараясь не задеть осадок клеток. Повторите процедуру еще дважды для достаточной промывки клеток; после последнего центрифугирования и добавления 150 µL C-R-P-M-I ресуспендируйте клеточный осадок с помощью многоканального дозатора. Перенесите смесь из каждой лунки в 800 µL C-R-P-M-I в лунку 24-луночного планшета для культивирования тканей. Затем поместите планшет в инкубатор для культур тканей при 37 °C и 5% CO2. Каждые два дня переносите 100 µL супернатанта с поверхности культуры в лунку 96-луночного U-образного планшета и замораживайте для последующего анализа с помощью RT-анализа. После этого тщательно ресуспендируйте клетки и удалите половину оставшегося объема, чтобы предотвратить избыточный рост клеток. Затем восстановите исходный объем, добавив по 550 µL свежей среды C-R-P-M-I в каждую лунку.

В данной процедуре к каждой аликвоте обратной транскрипции (RT master mix) объемом 1 мл добавьте от одного до двух мкл DTTP в концентрации 10 мКи/мл и четыре мкл 1 М DTT. Осторожно перемешайте содержимое каждой микроцентрифужной пробирки объемом 1,5 мл, содержащей RT master mix, DTT и DTTP, с помощью пипетки на 1000 мкл и перенесите смесь в стерильный желобок.

Затем внесите по 25 мкл меченой смеси для обратной транскрипции (RT mix) в каждую лунку 96-луночного PCR-планшета с тонкими стенками. Добавьте по 5 мкл каждого супернатанта в PCR-планшет, содержащий мастер-смесь для RT. Затем запечатайте PCR-планшет адгезивной фольгированной крышкой и инкубируйте в течение двух часов при 37 °C в термоциклере. После инкубации проделайте небольшие отверстия в фольгированной крышке с помощью 200 мкл многоканального дозатора. Перемешайте образцы пять раз. Перенесите по 5 мкл каждого образца на бумагу DE-81 и дайте всем образцам высохнуть на воздухе в течение 10 минут. Поместите блоты в отдельные контейнеры для промывки. Затем промойте блоты пять раз 1X SSC. После этого промойте их дважды 90% этанолом по пять минут на каждую промывку, после чего снова высушите на воздухе. После высыхания осторожно оберните блот пищевой пленкой и экспонируйте на фосфоэкране в плотно закрытой кассете в течение ночи при комнатной температуре.

После готовности проанализируйте фосфоэкраны с помощью фосфориметра и количественно определите содержание радиоактивных транскриптов.

Показано. На представленных изображениях гелей показано электрофоретическое разделение различных ПЦР-ампликонов, необходимых для создания ампликона gag, полученного от пациента и пригодного для клонирования в плазмидный остов MJ-four. Данное репрезентативное изображение геля демонстрирует электрофоретическое разделение продуктов рестрикции для клонирования генов gag пациента в MJ four.

На этом репрезентативном изображении геля представлена электрофоретическая сепарация продуктов рестрикции очищенной плазмидной ДНК химеры gag MJ-four. На данном графике показана воспроизводимость анализа репликации с течением времени в клеточной линии GXR-25. Одни и те же химерные вирусы gag MJ four использовались для заражения клеток GXR-25 в двух независимых экспериментах, проведенных с интервалом примерно в один год.

Показатели репликации были получены путем вычисления наклона логарифмически преобразованных значений DLU и нормализации этого наклона относительно дикого типа MJ-four. Два независимых измерения сильно коррелируют между собой, что подчеркивает воспроизводимость анализов, проведенных в разное время и с использованием клеток на разных пассажах. Этот метод открыл исследователям в области ВИЧ/СПИД возможность изучить вирусные детерминанты патогенеза при острой инфекции подтипа C, который является наиболее распространенным подтипом в мире. Работа с репликативно-компетентным ВИЧ может быть крайне опасной. Все этапы, связанные с живым вирусом, должны проводиться в лаборатории уровня BSL 2+. Все поверхности следует регулярно дезинфицировать, а throughout всего процесса использовать двойные перчатки.