Изоляция мышей Островок поджелудочной железы

Здравствуйте, я Грег Зотт из лаборатории Блустоуна Центра диабета UCSF. Сегодня я продемонстрирую вам процесс изоляции островков Лангерганса мыши. Процедура включает введение раствора коллагеназы в поджелудочную железу мыши-донора линии C3H, после чего мы извлечем поджелудочную железу, проведем ее ферментативное переваривание, очистим островки с помощью градиента Фиколла и затем вручную отберем их для последующей трансплантации в капсулу почки диабетической мыши линии NOD, которая будет выступать в качестве реципиента.

Перед началом данной процедуры мы развели раствор ATE в модифицированном буфере Хэнкса и скорректировали концентрацию специально для используемой нами линии мышей C3 H. Мы определили, что более эффективный лизис достигается при использовании раствора коллагеназы с концентрацией 0,8 mg/mL, который мы будем вводить в общий желчный проток для растяжения поджелудочной железы. Процедуру сегодня будет проводить Паво Кодре из центра диабета. Он вскроет мышь, обнажит кишечник и произведет инъекцию в общий желчный проток.

Мы опрыскаем мышь этанолом, чтобы пригладить шерсть, а затем проверим, была ли мышь правильно усыплена, с помощью щипка за палец. Теперь Паво вскроет мышь, обнажив кишечник и поджелудочную железу с помощью срединного разреза. Диафрагма также будет рассечена для подтверждения того, что животное мертво.

Прежде чем мы начнем, я хотел бы указать на некоторые важные структуры. Желудок расположен здесь; под ним прилежит поджелудочная железа, переходящая в двенадцатиперстную кишку. Это печень, где расположены желчный пузырь и общий желчный проток, который вы видите прямо здесь.

Далее Паво изолирует тонкую кишку и найдет место впадения общего желчного протока в тонкую кишку. После обнажения кишки мы накладываем зажимы-москиты по обе стороны от общего желчного протока. Мы обнаружили, что такой подход позволяет большему количеству коллагенатов проникать в поджелудочную железу, в то время как в других группах пытаются наложить зажим непосредственно на общий желчный проток.

Мы обнаружили, что данный метод более эффективен для обеспечения проникновения фермента в поджелудочную железу. Это щадящая процедура. Важно избегать разрывов кишечника.

Необходимо расположить зажимы так, чтобы они аккуратно прилегали к обеим сторонам общего желчного протока. Теперь найдем желчный пузырь; как только он будет обнаружен, мы используем его в качестве ориентира для введения коллагеназы в общий желчный проток. Пауэлл использует иглу 30G и шприц объемом 5 cc, содержащий 3 мл раствора коллагеназы.

При введении в общий желчный проток он расширяет этот проток раствором коллагеназы, затем продвигается по общему желчному протоку до области, прилегающей к кишечнику. По мере продвижения растворы ферментов закачиваются в поджелудочную железу. После того как поджелудочная железа будет заполнена раствором коллагеназы, Пауэлл снимет гемостаты, а затем аккуратно извлечет поджелудочную железу из организма мыши, осторожно отделяя ее от кишечника.

Он извлекает его из желудка. Затем, используя селезенку в качестве зажима, он приподнимает поджелудочную железу и медленно перерезает ее в области общего желчного протока. Поджелудочная железа отделена, после чего удаляется селезенка. Затем он удаляет брыжеечную ткань, после чего поджелудочная железа помещается в стерильный стеклянный флакон с раствором коллагеназы 2 mg/mL и снова ставится на лед.

Изолированную поджелужечную железу, помещенную в стеклянные флаконы, теперь следует поместить в водяную баню при температуре 37 °C примерно на 17 минут. Мы поместили их в конический штатив объемом 50 мл, чтобы флаконы не всплывали. С этого момента запускается таймер и начинается процесс переваривания.

По завершении времени дигестии пробирки извлекают, затем осторожно встряхивают для разрушения образца. Как только ткань начинает распадаться, пробирку помещают на лед. Над стаканом объемом 400 мл, содержащим промывочный буфер, устанавливают стерильное сито.

Затем дигестат поджелудочной железы осторожно переливают через сито в промывочный буфер. В демонстрационных целях вытяжной шкаф был выключен, а его стеклянная панель поднята, чтобы был виден процесс. После того как дигестат поджелудочной железы перелит в стакан, пробирки промывают тем же промывочным буфером, и этот буфер также сливают через сито.

У нас есть шприц, заполненный промывочным буфером. Мы будем использовать его для интенсивного промывания ткани через сито. Цель состоит в том, чтобы удалить все свободные глазчатые структуры, не прикрепленные к матриксу, оставив при этом мембраны и непереваренную ткань на сите.

После завершения промывки ткани результат обычно выглядит так, как показано в конце процедуры. Ткань поджелудочной железы, находящуюся на дне пробирки, теперь переносят в две конические пробирки объемом 50 мл; ткань промывают, равномерно перемешивают, а затем распределяют так, чтобы в каждой пробирке был одинаковый объем осадка. Стакан теперь промывают дополнительным промывочным буфером.

Стенки промывают, чтобы весь перенесенный в стакан материал снова попал в раствор. Затем содержимое равномерно распределяют между двумя коническими пробирками по 50 мл. После этого пробирки доверху заполняют промывочным буфером.

Ткань несколько раз переворачивают, после чего помещают в центрифугу. Проводится кратковременное центрифугирование. Центрифугу разгоняют до 1000 RPM, а затем выключают.

В данный момент ткани очень чувствительны, и не следует подвергать их чрезмерному уплотнению. Пробирки извлекают, и этот этап промывки повторяют еще трижды. Это завершение третьей промывки.

Содержимое конической пробирки объемом 50 мл переносят в коническую пробирку объемом 15 мл и центрифугируют при 1000 rpm, после чего центрифугирование прекращают. Супернатант удаляют, и начинают первую часть протокола FI Call. На данном этапе мы имеем осадок дигеста поджелудочной железы.

Мы ресуспендируем ткань, чтобы она была достаточно однородной и не слипалась в агрегаты. Затем мы добавим первый градиент плотности 1.108. В каждую пробирку добавим по 5 мл.

Затем осадок тщательно перемешивают в каждом из градиентов. Важно обеспечить хорошее распределение ткани в самом тяжелом градиенте. Теперь мы нанесем слоем 2 мл раствора с плотностью 1,096.

Затем поверх этого мы нанесем слой плотностью 1.069 толщиной две тысячих дюйма, а затем слой плотностью 1.037. Важно, чтобы при наслоении различных плотностей они не смешивались. Теперь все слои добавлены в пробирку.

И вы видите верхнюю часть пробирок 1108, 91096, 1069 и 1037. Видно, что ткань уже начинает перемещаться к своей расчетной плотности даже без центрифугирования. Градиенты в пробирках доводят до рабочей скорости при 1800 RPM в течение 15 минут; помните, что после извлечения пробирок из центрифуги тормоз должен быть выключен.

Между слоями 0 0 9 6 и 0 0 7 видна четкая полоса ткани островков. Теперь удаляют слой 0 3 7, чтобы убрать любые остатки тканей и ДНК, которые могли высвободиться в процессе обработки. Используя стерильную пластиковую пипетку-пастер, Пабло удаляет слой островков и переносит их в коническую пробирку объемом 50 мл, содержащую 25 мл промывочного буфера.

Этот этап следует выполнить быстро, так как fol токсичен для островков. Мы фактически удалили весь слой 0 6 9 и 0 9 6. Паво отрезает верхнюю часть пластиковой пастерновской пипетки и промывает ее промывочным буфером.

Затем глазные яблоки центрифугируют так же, как и в предыдущий раз. Скорость центрифугирования доводят до 1000 RPM, после чего центрифугу останавливают и аспирируют супернатант. Глазные яблоки промывают трижды в промывочной среде.

Таким образом, мы завершили процесс изоляции островков: от переваривания через градиент плотности до получения очищенных островков. После третьей промывки промывочным буфером мы ресуспендировали островки в среде RPMI и перенесли их в планшет для культивирования тканей. Теперь эти островки готовы для проведения анализов in vitro или подготовки к процедурам in vivo, таким как трансплантация островков.