Мышь Островок Лангерганса изоляции с использованием комбинации Очищенный коллагеназы и нейтральной протеазы

Общая цель данной процедуры заключается в успешном выделении островков из поджелудочной железы мыши. Это достигается путем предварительного отделения поджелудочной железы от окружающих тканей. Затем в желчный проток вводится канюля, чтобы обеспечить раздувание поджелудочной железы смесью коллагеназы и протеазы.

После раздувания поджелудочную железу извлекают, и проводят осторожную диссоциацию островков. На заключительном этапе изолированные островки фильтруют и высевают на планшеты для дальнейшего использования. В конечном итоге данный метод изоляции островков с использованием очищенной коллагеназы и нейтральной протеазы применяется для получения максимального выхода островков и обеспечения их оптимальной морфологии.

Основным преимуществом данного метода по сравнению с существующими способами выделения островков является устранение вариабельности между партиями за счет использования очищенных ферментов. Кроме того, мы внесли изменения и улучшения в некоторые протоколы для улучшения морфологии островков. После эвтаназии покройте туловище 70%ethanol перед полным вскрытием брюшной полости от анального отверстия до диафрагмы.

Затем поместите мышь на платформу диссекционного микроскопа. Извлеките слепую кишку и восходящую часть ободочной кишки, выведите их за пределы брюшной полости; сместите доли печени влево, прижав их к диафрагме. Если они не удерживаются в таком положении самостоятельно, увеличьте разрез брюшной полости.

Захватите двенадцатиперстную кишку изогнутым зажимом и найдите пучок из печеночной артерии, воротной вены и желчного протока, идущий к печени. С помощью другого изогнутого зажима проведите шовный материал под пучком артерии, вены и протока и затяните его как можно ближе к печени.

Используя два пары изогнутых пинцетов, осторожно захватите двенадцатиперстную кишку и найдите желчный проток в области сосочка. Одним концом пинцета аккуратно проколите поджелудочную железу и соединительную ткань непосредственно под желчным протоком рядом с сосочком. Быстрым движением проведите пинцет через отверстие и введите шовную нить. Свободно завяжите нить вокруг желчного протока, формируя небольшую петлю с помощью углового пинцета.

Растяните тонкий кишечник, пока желчный проток не натянется. С помощью сверхтонких ножниц сделайте один горизонтальный разрез через сосочек, придерживая кишечник так, чтобы не сместить желчный проток относительно сосочка. Введите канюлю в желчный проток, после чего аккуратно затяните шов вокруг канюли.

Затем наполните трехмиллилитровый шприц 2,0 миллилитрами смеси коллагеназы и протеазы. Медленно и равномерно введите эту смесь через канюлю. После полного раздувания поджелудочной железы извлеките канюлю из желчного протока.

Начиная с нисходящей ободочной кишки, перережьте соединительную ткань, аккуратно приподнимая кишечник, пока не достигнете желчного протока. Затем отделите поджелудочную железу от селезенки и окружающих тканей. В завершение перережьте швы и извлеките поджелудочную железу.

После извлечения поместите поджелудочную железу в пробирку объемом 50 миллилитров, содержащую 5 миллилитров HBSS, на льду. После сбора всех образцов поместите все пробирки объемом 50 миллилитров с тканью поджелудочной железы в водяную баню с температурой 37 °C. В течение 15 минут осторожно покачивайте пробирку, контролируя диссоциацию ткани.

Убедитесь, что ткань легко распадается, удерживая пробирку за крышку. Сделайте 12 круговых движений для дальнейшей диссоциации ткани. Добавьте не более 30 milliliters HBSS и центрифугируйте.

Осторожно аспирируйте супернатант, оставив небольшое количество жидкости на дне, чтобы не повредить осадок клеток. Используя шприц объемом 30 миллилитров с иглой 14G, добавьте не более 10 миллилитров HBSS и дважды перемешайте суспензию, набирая и вытесняя её из шприца. Профильтруйте клеточную смесь через пластическое Т-сито в пробирку объемом 50 миллилитров.

Промойте еще 10 миллилитрами HBSS и центрифугируйте. Слейте супернатант и переверните пробирки на абсорбирующее бумажное полотенце на одну минуту для полного удаления жидкости. Ресуспендируйте содержимое каждой пробирки в 10 миллилитрах.

Охладите до 1100. Его непрозрачный слой, его непрозрачный. С помощью 10 миллилитров HBSS центрифугируйте. Удалите все 20 миллилитров супернатанта, используя пипетку объемом 25 миллилитров с широким отверстием, и пропустите супернатант через перевернутый фильтр с размером пор 70 микрон.

Отфильтруйте глазки непосредственно в чашку Петри и промойте их, пропипетировав 10 миллилитров среды для глазков через фильтр с культурой. Поместите глазки в инкубатор для культур тканей до начала экспериментов. Выход, морфология и качество глазков являются общими параметрами, используемыми для оценки успешности изоляции глазков.

Здесь представлена типичная морфология островков. Островки имеют округлую или продолговатую форму и относительно однородный размер. Здесь изолированные островки были проанализированы на предмет секреции инсулина, стимулируемой глюкозой.

Стимуляция инсулином была схожей при использовании островков, подготовленных с помощью Sigma Type 11, по сравнению с ci zyme TM, MABP, что указывает на высокое качество подготовки островков. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как проводить канюлирование желчного протока мыши. Используйте zyme коллагеназу и нейтропротеазы для выделения островков для любого анализа.