Мониторинг динамических изменений в митохондриальной уровня кальция во время апоптоза Использование генетически закодированные Кальций датчика

Общая цель данной процедуры заключается в мониторинге изменений концентрации кальция в митохондриях живых клеток. Для этого сначала проводят трансфекцию клеток рациометрическим белком-индикатором кальция peram, который направляется в митохондриальный матрикс; через один или два дня после трансфекции флуоресцентный микроскоп и программное обеспечение настраивают для визуализации живых клеток.

Затем, после добавления агониста, мобилизующего кальций, получают изображения клеток, экспрессирующих рациометрический Peram. Заключительным этапом процедуры является количественный анализ полученных изображений. В итоге можно получить результаты, демонстрирующие динамические изменения концентрации кальция в митохондриях с помощью флуоресцентной микроскопии живых клеток, экспрессирующих рациометрический белок-индикатор кальция.

Основным преимуществом данного метода по сравнению с существующими способами, такими как измерение уровней кальция с помощью синтетических индикаторов кальция, является то, что рациометрический Pericam генетически кодируется и, следовательно, может быть направлен в митохондрии или любой другой интересующий органоид. Здравствуйте, я доктор Аскар, постдок в лаборатории доктора Беннинга, и сегодня я продемонстрирую данную процедуру. Для начала протокола накануне вечером высейте клетки HeLa на стерильные стеклянные покровные стекла, помещенные в стандартный шестилуночный культуральный планшет, с плотностью, которая обеспечит примерно 70% конфлюэнтности к моменту трансфекции на следующий день. На следующий день приготовьте комплексы ДНК с Lipofectamine 2000 согласно инструкциям производителя, используя 4 µg вектора для митохондриальной экспрессии рациометрического Pericam и 10 µL Lipofectamine 2000, разведенных в 0,5 mL Opti-MEM для каждой лунки, подлежащей трансфекции.

Затем замените культуральную среду D-M-E-M-F-B-S HELOC в каждой лунке на 1,5 milliliters той же среды без антибиотиков. Добавьте раствор LIPECTOMY к раствору ДНК и аккуратно перемешайте после образования комплексов. Покапельно добавьте раствор ДНК Lipectomy в каждую лунку, предназначенную для трансфекции, перемешайте, осторожно покачивая планшет, и инкубируйте в течение четырех часов в инкубаторе для культур клеток при 37 °C и 5% carbon dioxide после инкубации.

Замените среду на DMEM-FBS с добавлением антибиотиков. Оставьте клетки для экспрессии metric peram на один-два дня перед визуализацией. С помощью пинцета осторожно поместите покровное стекло с клетками HELOC в соответствующую камеру для визуализации с раствором для имиджинга.

Установите камеру для визуализации на предметный столик инвертированного микроскопа. Затем используйте иммерсионный объектив с увеличением 40x или выше и длину волны 380 нм. Для поиска интересующей области, содержащей одну или несколько клеток, экспрессирующих рациометрический peram, здесь используется длина волны 380 нм для идентификации рациометрических клеток.

Peram менее устойчив к фотообесцвечиванию при данной длине волны. После определения интересующей области настройте программное обеспечение для двойного возбуждения при 495 и 380 нанометрах. Затем последовательно получите изображения, поочередно используя возбуждение при 495 и 380 нанометрах.

Регистрируйте изображения базового уровня кальция в течение как минимум 30 секунд перед введением агониста. Затем введите мобилизующий кальций агонист с помощью системы перфузии, зафиксировав время добавления. Время экспозиции для каждого агониста и интервалы регистрации следует оптимизировать, чтобы предотвратить фотообесцвечивание, сохраняя при этом достаточное временное разрешение. После завершения эксперимента изображения можно проанализировать в автономном режиме.

Для начала анализа выберите область интереса на пустом участке поля зрения, чтобы при необходимости вычесть фоновую флуоресценцию. Затем экспортируйте значения соотношения 4 95 3 80 из области интереса в Excel или аналогичное программное обеспечение для построения графиков. На данной панели изображений показана субклеточная локализация рациометрического peram и митохондрий.

Слева представлено изображение живых клеток HeLa, экспрессирующих рациометрический Pericam. В центре показано флуоресцентное окрашивание митохондрий селективным красителем MitoTracker Red CMXRos. И наконец, справа приведено совмещенное изображение, представляющее собой серию рациометрических изображений в псевдоцветах при 495 и 580 нм для четырех клеток HeLa, экспрессирующих рациометрический Pericam в митохондриях и обработанных 10 µM ATP; количественная оценка изменений уровня митохондриального кальция в этих четырех клетках показана здесь, на изображении клетки HeLa, экспрессирующей рациометрический Pericam в митохондриях.

Гетерогенность кальциевого ответа в отдельных митохондриях, а также значительная фрагментация митохондрий становятся очевидными к 60 минутам обработки 0.5 µM стороспорина. В одних митохондриях наблюдаются осцилляторные повышения уровня кальция, отмеченные белой стрелкой, тогда как в других существенных изменений уровня кальция не наблюдается, что отмечено желтой стрелкой. На данном графике показано изменение глобального уровня кальция в митохондриях одной клетки HeLa после индукции апоптоза в течение 120 минут с помощью 0.5 µM стороспорина.

После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как измерять динамические изменения уровней митохондриального кальция в ответ на различные стимулы с использованием кальций-зависимого белка R-geometrically peram, который селективно направляется в митохондриальный матрикс.