Microarray анализа для Saccharomyces CEREVISIAE

Общая цель данной процедуры — познакомить студентов научных специальностей с технологией микрочипов путем изучения различий в экспрессии генов дрожжей, подвергнутых окислительному стрессу. Для этого сначала выделяют общую РНК из культур дрожжей, обработанных перекисью водорода, и из необработанных контрольных образцов. Вторым этапом процедуры является синтез и очистка кДНК из этих образцов РНК.

Затем кДНК используется для подготовки биотинилированной кРНК посредством транскрипции in vitro. Завершающим этапом процедуры является фрагментация биотинилированных кРНК для последующей гибридизации с дрожжевыми генными чипами AFI metrics. В конечном итоге можно получить результаты, демонстрирующие различия в экспрессии двух образцов дрожжей, и с помощью биоинформатики показать студентам бакалавриата возможности анализа на микрочипах.

Команда по внешним связям сети генетических исследований Вермонта (Vermont Genetics Network Outreach) впервые задумала этот метод, когда перед ними была поставлена задача внедрить технологию микромассивов для студентов естественнонаучных специальностей по всему штату Вермонт с целью повышения качества их образования. На сегодняшний день этот метод был внедрен в нескольких учебных центрах восьми колледжей бакалавриата по всему штату. Таким образом, основным преимуществом использования микромассивов в качестве учебных модулей является возможность обучения группы людей общим методам молекулярной биологии, которые ежедневно применяются в лабораторной практике.

Кроме того, мы используем это для обучения как студентов, так и преподавателей, а также наших исследовательских групп. У нас студенты и профессора работают вместе над одним и тем же проектом. Они осваивают определенные методики, требующие высокого мастерства, такие как работа с RNA, что является непростой задачей.

Они узнают, как осаждать ДНК с помощью реагентов для визуализации. Таким образом, они получают возможность использовать методы, с которыми столкнутся в аспирантуре или в повседневной работе в лабораториях молекулярной биологии. Хотя данный метод подходит для изучения окислительного стресса у дрожжей, он, безусловно, применим и к другим модельным организмам, а также к иным биологическим системам, которые могут вас заинтересовать.

Изменения экспрессии генов могут быть связаны с особенностями развития, воздействием экологических токсинов, специфическими патологическими состояниями и многими другими факторами. Для изучения различий в экспрессии генов у дрожжей, подвергнутых окислительному стрессу, сначала проводят экстракцию всей РНК из двух культур дрожжей с помощью ферментативного лизиса. Одну культуру подвергали окислительному стрессу путем воздействия 0,5 мМ перекиси водорода в сбалансированном солевом растворе Хенкса (HBSS) в течение одного часа, в то время как вторую культуру обрабатывали только HBSS в качестве контроля.

Начните с маркировки двух микроцентрифужных пробирок объемом 1,7 мл соответствующей идентификационной информацией. Перенесите по 1,5 мл соответствующей культуры дрожжей в каждую пробирку. Центрифугируйте пробирки при 5 000 G в течение двух минут при комнатной температуре.

После центрифугирования с помощью микропипетки осторожно удалите и отбросьте супернатант, стараясь не повредить осадок. Перед продолжением процедуры убедитесь, что объем осадка достаточен. Если осадок слишком мал, добавьте в ту же пробирку с осадком 1.5 milliliters культуры и снова центрифугируйте для получения большего количества осадка.

Удалите супернатант с помощью микропипетки, максимально удалив жидкость из осадка дрожжей. Затем добавьте к осадку дрожжей 100 µL буфера SG и 30 µL раствора лиазы, после чего перемешайте на вортексе. Инкубируйте обе пробирки в течение 30 минут при комнатной температуре.

Осторожно перемешивайте каждую пробирку каждые 10 минут для образования сферопластов. Одним из наиболее критических этапов при посеве сферопластов дрожжей является проверка того, что после обработки действительно были созданы стопроцентные сферопласты. Это означает, что не все литические ферменты обладают одинаковой эффективностью.

Таким образом, необходимо убедиться, что подходящий литический фермент обеспечивает качественное формирование сфероидов; для этого следует перенести данные образцы на предметное стекло и проверить их под микроскопом, добавив 0,1%SDS, чтобы подтвердить образование протопластов. Чтобы наблюдать полное формирование сфероидов, пипеткой нанесите 10 µl образца дрожжей на предметное стекло, после чего исследуйте образец под микроскопом, добавив 1 µl 0,1%SDS, чтобы вызвать набухание дрожжевых клеток и превращение их в идеальные сферы или сфероиды. Важно убедиться, что почкующиеся клетки также образуют сфероиды.

При наблюдении частичного осаждения сфероидов рекомендуется продлить обработку лиазой. После подтверждения полного осаждения сфероидов при добавлении 350 µL буфера BRLT в каждую пробирку добавьте 250 µL 100% ethanol. Плотно закройте пробирку, удерживая крышку, и интенсивно перемешайте на вортексе в течение одной минуты.

Данная процедура предназначена для лизиса плат Sphero. После этого используйте спин-колонки R и easy Z для сбора и очистки РНК из двух культур. Наконец, оцените качество экстрагированной РНК с помощью 1,2% готового агарозного геля для электрофореза, чтобы подготовить меченную биотином сРНК.

Общая РНК, экстрагированная из клеток дрожжей, сначала используется для синтеза кДНК посредством обратной транскрипции. После получения кДНК подготовьте гелевые пробирки Phase Lock для осаждения кДНК. Центрифугируйте пробирки Phase Lock на максимальной скорости в течение одной минуты, чтобы гель осел на дно пробирки. Не встряхивайте пробирки Phase Lock на вортексе. Для осаждения кДНК перенесите 162 µL нижнего слоя смеси трис-буферизированного фенол-хлороформа-изоамилового спирта (PCI) с pH 8,0 к 162 µL содержимого пробирки с реакцией синтеза второй цепи кДНК; на данном этапе требуются равные объемы водных и органических смесей.

Перемешайте содержимое на вортексе в течение пяти секунд. Затем с помощью микропипетки перенесите всю смесь CD N-A-P-C-I в пробирку с фазовым блокирующим гелем. Не подвергайте пробирку с фазовым блокирующим гелем вортексированию; центрифугируйте на максимальной скорости в течение двух минут.

Затем с помощью микропипетки перенесите верхний слой из пробирки с гелем для разделения фаз в новую промаркированную пробирку объемом 1,7 мл. Постарайтесь собрать максимально возможный объем этого слоя. Добавьте в микроцентрифужную пробирку объемом 1,7 мл следующие компоненты: 405 µL 100% этанола, 80 µL ацетата аммония и 1 µL красителя для осадка, затем перемешайте на вортексе.

Поместите пробирку в центрифугу так, чтобы крышка была направлена наружу, и центрифугируйте на максимальной скорости в течение 20 минут. После завершения центрифугирования при комнатной температуре аккуратно извлеките пробирку из центрифуги, стараясь не повредить осадок CD NA. Осадок должен быть розового цвета благодаря красителю и иметь размер примерно с крупинку соли.

Поставьте пробирку с пеллетом CD NA на лед (под шарнир крышки) и немедленно приступайте к его очистке. Для начала процедуры очистки пеллета CD NA с помощью микропипетки P 1000 аккуратно удалите из пробирки весь супернатант. Будьте осторожны, чтобы не повредить пеллет.

Добавьте в пробирку с образцом 500 µL холодного 80% этанола. Осторожно закройте пробирку крышкой и медленно переверните ее несколько раз. Внимательно следите за осадком, чтобы он не отделился от стенки пробирки.

Если осадок отсоединился, его можно вернуть на дно пробирки, либо поместив пробирку обратно в штатив и дав осадку осесть, либо центрифугировав пробирку на максимальной скорости в течение 15 секунд. Затем с помощью микропипетки P 1000 осторожно удалите этанол, не затрагивая осадок. Наклоните пробирку, чтобы удалить максимально возможный объем жидкости.

Добавьте новый объем холодного 80% этанола, закройте пробирку крышкой и несколько раз медленно переверните ее. Удалите весь возможный этанол с помощью микропипетки P 1000. Центрифугируйте пробирку на максимальной скорости в течение пяти секунд.

Затем с помощью микропипетки P 10 удалите последние несколько микролитров этанола, стараясь не задеть осадок. Поместите открытую пробирку в эксикатор на 10–20 минут для испарения остатков этанола. После высыхания осадок легко теряется, поэтому осторожно обращайтесь с пробиркой и плотно закройте крышку.

После завершения высушивания визуально проверьте наличие высушенного осадка в пробирке. Наконец, ресуспендируйте высушенный осадок в 22 µL воды, не содержащей РНК, и поместите пробирку на лед. Полученная кДНК затем используется для подготовки биотинилированной кРНК путем транскрипции in vitro с использованием набора Enzo BioArray.

После очистки и количественного определения биотинилированной cRNA ее фрагментируют для подготовки мишеней. После синтеза cDNA мы используем стандартную методику транскрипции in vitro для получения биотинилированной cRNA. Перед нанесением на микрочип cRNA должна пройти стадию фрагментации.

Для начала данной процедуры перенесите количество CRNA, эквивалентное 5 µg, в промаркированную ПЦР-пробирку объемом 0,5 мл. Добавьте достаточное количество воды, свободной от РНК, чтобы довести общий объем до 16 µl, затем добавьте в пробирку 4 µl 5-кратного буфера для фрагментации. Общий объем в пробирке должен составить 20 µl.

Перемешайте содержимое пробирки на вортексе и центрифугируйте в течение 10 seconds. Затем инкубируйте пробирку при 94 °C в течение 30 minutes. После инкубации в термоциклере поместите пробирку на лед.

Затем фрагментированная и нефрагментированная кРНК из каждого образца анализируется методом электрофореза с использованием готового AROS-геля с концентрацией 1,2%. По завершении разделения гель визуализируют на трансиллюминаторе и делают снимок. Конечный продукт синтеза гибридизируют с микрочипами аттрикульных генов дрожжей; репрезентативные результаты микрочипового анализа представлены здесь.

На данном первом рисунке представлен пример сканированного изображения генного чипа дрожжей atrics, созданного с помощью операционного программного обеспечения генного чипа atrics. Это двумерная диаграмма рассеяния всех генетических транскриптов (около 6 700 генов), в которой сравниваются данные по контрольным дрожжам и дрожжам, подвергнутым воздействию. Каждая точка представляет собой один ген.

Гены, выделенные фиолетовым цветом, обозначают дифференциально экспрессируемые гены, в то время как гены, выделенные красным, таковыми не являются. В данном примере большинство дифференциально экспрессируемых генов задействованы в контроле клеточного цикла, на что указывают их описания. Эта блок-схема из базы данных для визуализации аннотаций и комплексного поиска иллюстрирует дифференциально экспрессируемые гены в затронутом биологическом пути.

Гены, отмеченные красной звездочкой, представляют собой гены с пониженной экспрессией в пути митоза. Наконец, здесь представлены репрезентативные результаты в виде графика «вулкан» (volcano plot), созданного с помощью программного обеспечения geo species gene sifter. Контрольные образцы и образцы после воздействия сравнивали с пороговым значением P-value 0,05 и порогом изменения экспрессии в 1,5 раза.

Мы выбрали использование дрожжей, так как они легко и быстро растут, однако мы также осознали, что наиболее критическим этапом работы с дрожжами является создание качественных сферопластов для посева. Одной из проблем при использовании микрочипов является риск неполного переваривания, при котором сферопластами становятся только те клетки, которые находятся в G1 или G2/M фазе. В таком случае эксперимент с микрочипом проводится на дрожжах, находящихся в определенной фазе репликации.

Еще один сложный момент, который мы пытаемся разъяснить в этом упражнении, заключается в том, что осаждение CD NA обсуждается повсеместно, но на практике оно не всегда проходит легко. В нашем модуле мы использовали специализированные пробирки и реагенты для визуализации. Это позволяет нам центрифугировать DNA и визуализировать осадок, что значительно облегчает процесс как для студентов, так и для преподавателей.

Таким образом, после разработки этот модуль может быть использован на всех этапах работы с ДНК и РНК. Он открыл преподавателям бакалаврских институтов путь к дальнейшим исследованиям, что позволило им изучать другие модельные организмы или режимы обработки, совместимые с существующими учебными программами или их собственными научными интересами. В качестве примера модификаций можно привести один из центров, где изучалось воздействие гербицидов на дрожжи, другой, где рассматривалась обработка дрожжей с помощью LAMP IDE, а также центр, исследовавший особенности развития конкретной клеточной линии млекопитающих, представлявшей для них особый интерес.

И, наконец, в другом исследовании изучалось влияние различных источников света на arabidopsis или растения. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как организовать эксперимент с использованием микрочипов для студентов естественнонаучных специальностей, включая выделение общей РНК из дрожжей, синтез кДНК и фрагментацию биотинилированной кРНК. Практический опыт работы с такими высокотехнологичными методами способствует закреплению и повышению качества высшего естественнонаучного образования.