Определение генетических профилей выражения в С. Элеганс Использование Microarray и ПЦР в реальном времени

Общая цель данной процедуры заключается в исследовании профилей экспрессии генов, лежащих в основе многочисленных фенотипов или метаболических путей. Это достигается путем первоначального выделения мРНК из двух контрастных штаммов нематод. Вторым этапом процедуры является синтез кДНК, содержащей либо последовательности захвата S SI three, либо SFI, и их гибридизация с микрочипом.

Третьим этапом процедуры является гибридизация микрочипа с антизахватывающими последовательностями, содержащими S SI 3 и SCIFI флуорофоры. Заключительным этапом процедуры является сканирование микрочипа и анализ данных с помощью биоинформатических инструментов, таких как программное обеспечение magic tool. В конечном итоге идентифицируются гены-кандидаты, опосредующие исследуемый биологический феномен, которые могут быть подтверждены и количественно определены с помощью альтернативных методов, таких как ПЦР в реальном времени.

Как правило, специалисты, которые только начинают осваивать этот метод, сталкиваются с трудностями, поскольку нанесенные на подложку нуклеотиды не видны пользователю, из-за чего затруднительно равномерно распределить гибридизационную смесь по более чем 23 000 уникально нанесенным нуклеотидам. Начните со сбора РНК из здоровых синхронизированных нематод. Сначала их промывают, ресуспендируют в пробирках объемом 15 мл и осаждают; осадки червей ресуспендируют в 7 мл 0,1 M NaCl и 7 мл ледяного 60% (w/v) раствора сахарозы.

После 15-минутной инкубации на льду черви снова осаждаются центрифугированием. Теперь очищенные от бактерий черви всплывают на поверхность, после чего их собирают, промывают в воде, свободной от РНК, и снова осаждают. Затем чистый, рыхлый осадок переносят в микроцентрифужную пробирку и центрифугируют на максимальной скорости в течение 30 секунд.

Аспирируйте и храните в 10 объемах RNAlater при температуре four degree Celsius до начала дальнейших процедур. Для подготовки образцов общей РНК центрифугируйте полученные осадки на максимальной скорости, удалите супернатант и добавьте к осадку щепотку молекулярной измельчающей смолы. Затем заморозьте смесь с помощью жидкого азота, используя пестик.

Разотрите замороженную суспензию червей в мелкий порошок, при необходимости добавляя жидкий азот, чтобы порошок оставался холодным после измельчения. Поместите экстракт на лед на пять минут. По истечении пяти минут смешайте экстракт с 700 µL R-L-T-B-M-E и 472 µL 100% ethanol.

Сейчас РНК можно выделить с помощью именного в продаже набора до конечного объема 60 µL выделенной РНК на один биологический образец. Перед тем как продолжить, удалите возможное загрязнение геномной ДНК, обработав образец препаратом DNase I, после чего используйте именный в продаже набор для очистки РНК. Завершите работу с набором, доведя объем до 60 µL.

Наконец, определите концентрацию РНК и оцените ее целостность с помощью анализа образцов с использованием глиоксаля, красителя и гель-электрофореза перед гибридизацией на микрочипе. Используя общепринятые методы, очищенную РНК подвергают обратной транскрипции в комплементарную ДНК, которую затем очищают от деградировавшей матрицы с помощью коммерчески доступного набора и доводят объем до 60 µl. Начните гибридизацию на микрочипе с блокировки стекол микрочипа соницированной ДНК спермы лосося. Через час промойте заблокированные стекла дважды дистиллированной водой и центрифугируйте.

Высушите стекла в конических пробирках объемом 50 milliliter, проложив их салфетками Kimwipe. Теперь приготовьте 2x гибридизационный буфер на основе формамида. Сначала прогрейте его при температуре 55 °C в течение 10 минут для полного растворения кристаллов.

Затем центрифугируйте пробу в течение одной минуты при 10,000 gs. Далее смешайте 25 µL CD NA с 25 µL гибридизационного буфера и аккуратно перемешайте смесь легкими постукиваниями. После этого кратковременно центрифугируйте смесь и инкубируйте ее при 80 °C в течение 10 минут.

После инкубации осторожно перенесите весь образец кДНК пипеткой на подложку микрочипа, не касаясь самой подложки. Для равномерного распределения образца по подложке микрочипа аккуратно наложите покровное стекло, используя иглу шприца; прежде чем стекло полностью опустится, приподнимите его и снова опустите с помощью иглы, позволяя покровному стеклу плавно встать на место.

Данный метод сводит к минимуму образование пузырьков воздуха. Поместите предметное стекло горизонтально в коническую пробирку объемом 50 milliliter, добавив под стекло 50 µL дважды дистиллированной воды, и оставьте для инкубации на ночь при 37 °C. На следующий день, после промывки стекла, проводят вторую гибридизацию.

Несколько раз в SSC второй буфер, содержащий светочувствительные реагенты для захвата и реагент Antifa, наносится тем же способом с последующей короткой инкубацией, дополнительными промывками и высушиванием. После этого слайд можно отсканировать. Анализ изображений можно проводить с помощью бесплатного программного обеспечения с открытым исходным кодом magic tool.

Перейдя на вкладку «Project» (Проект), создайте и сохраните новый проект. Затем на вкладке «Build Expression Profile» (Построение профиля экспрессии) выберите «Load Image Pair» (Загрузить пару изображений) и укажите файл красного изображения в поле «Red», а файл зеленого изображения — в поле «Green». После этого снова перейдите на вкладку «Build Expression Profile». Выберите «Load Gene List» (Загрузить список генов), чтобы загрузить файл со списком генов C. elegance, полученный с сайта GCAT, для разметки и привязки сетки изображения микрочипа.

Перейдите на вкладку «Build expression profile» и выберите опцию «Create edit grid». Теперь отредактируйте сетку. В появившемся диалоговом окне укажите 48 в качестве количества сеток, 22 строки и 22 столбца для каждой сетки, а также выберите нумерацию позиций слева направо и сверху вниз.

Увеличьте процент изменения контрастности и масштабируйте сетку до тех пор, пока отдельные пятна не станут отчетливо различимы. Создайте сетки, выбрав верхнее левое пятно на левой панели, затем кликнув в центр верхнего левого пятна, затем по верхнему правому пятну и по нижнему ряду в первой сетке. Повторите эту процедуру построения сетки для каждой из 48 сеток, двигаясь слева направо и сверху вниз.

Затем сохраните данные, перейдя на вкладку «file» и выбрав «save current grid as». Перейдите на вкладку «finished», чтобы исключить из анализа любые посторонние пятна. Откройте вкладку «build expression profile» и в разделе настроек адресации сетки («addressing gridding option») выберите «spot flagging».

Теперь отметьте любые полосы или фоновую флуоресценцию и сохраните изменения, выбрав «save current flags». Затем перейдите на вкладку «file» и проведите сегментацию отмеченных файлов. Наконец, проанализируйте гены, индуцированные или репрессированные определенным фактором, выбрав «explore» на вкладке «expression».

В диалоговом окне поиска установите критерии точного соответствия генов. Укажите количество двукратных увеличений или уменьшений экспрессии. Интенсивность обозначается как x, а значение X является критерием изменения экспрессии.

Значение X вводится как максимальное значение больше X для индуцированных генов и минимальное значение меньше x для репрессированных генов. В данном эксперименте проводится контроль с обменом красителей: две независимые порции выделенной тотальной РНК из личинок третьей и четвертой стадий гибридизуются либо как зеленый мутант против красного дикого типа, либо как красный мутант против зеленого дикого типа для подтверждения изменений экспрессии генов. Выполните три независимых выделения тотальной РНК по той же процедуре, синтезируйте кДНК с помощью имеющегося в продаже набора и для каждого образца кДНК проведите ПЦР в реальном времени в трех повторах, используя три гена «домашнего хозяйства» в качестве контролей. Для демонстрации ниже приведены результаты анализа экспрессии генов, индуцированных в VSM one.

Мутанты AK 1468 — это штамм нематод, характеризующийся усиленной синаптической передачей. Перед проведением микроматричного анализа качество экстрагированной РНК проверяют с помощью гель-электрофореза. Наличие двух неповрежденных рибосомальных субъединиц до и после обработки RNase one свидетельствует о высоком качестве образца РНК. В микроматричном анализе кДНК дикого типа помечена красным, а кДНК мутанта VSM one — зеленым. На одной из 48 сеток, анализируемых в каждом микроматрице, каждый маленький квадрат представляет собой один нанесенный олигонуклеотид; в каждом массиве представлен каждый уникальный олигонуклеотид.

После того как микрочиповый анализ транскриптов, выделенных из личинок четвертой стадии, показал, что гены, кодирующие основные белки сперматозоидов (MSP), индуцируются у мутантов VSM one, микрочиповый анализ личинок третьей стадии также выявил изменения экспрессии внутри того же семейства генов у мутанта. Проверка прогнозов микрочипового анализа с помощью ПЦР в реальном времени показала, что один из членов семейства генов MSP, MSP 32, индуцируется у мутантов VSM one. Данные представляют собой среднее значение трех повторностей ПЦР в реальном времени из одной и той же пробы РНК.

После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как работать с биоинформатическими инструментами для полногеномного анализа, особенно с учетом того, что научному сообществу доступно множество биоинформатических программ с открытым исходным кодом.