Подсчет правам нервные стволовые клетки
22 августа 2007 г.
Знание точного числа жизнеспособных клеток требуется для многих манипуляций культуры ткани. Этот протокол описывает, как различать живых и мертвых клеток и клеток с использованием количественно hemacytometer. Хотя она описывает подсчета человека нейронных стволовых / клеток-предшественников (hNSPCs), он может быть использован для других типов клеток.
Теперь я покажу вам, как подсчитывать клетки-предшественники нейронов человека; подсчет клеток необходим перед проведением иммуноцитохимического анализа или трансфекции с использованием ядерного фактора. Я использую гемоцитометр с фазовым контрастом, имеющий сеточную разметку, а также краситель трипановый синий. Этот краситель полезен тем, что позволяет дифференцировать живые и мертвые клетки.
Мертвые или умирающие клетки поглощают этот краситель и окрашиваются в синий цвет. При изучении клеток с помощью гемоцитометра видно, что живые клетки способны исключать этот краситель, поэтому они не окрашиваются в синий цвет. Таким образом можно определить жизнеспособность ваших клеток; для этого приготовьте раствор трипанового синего в среде.
Я добавлю 20 µL раствора trypan blue в эту эпидоринковую пробирку объемом 0,5 мл. Затем я добавлю 25 µL среды. Таким образом, сейчас у меня есть 45 µL раствора trypan blue со средой, чтобы при добавлении 5 µL клеточной суспензии получилось разведение 1:10.
Теперь я добавлю 5 µL клеточной суспензии. Сначала я убежусь, что клетки хорошо ресуспендированы, используя метод перемешивания пальцем (finger vortexing). Таким образом, я хочу убедиться, что данный раствор хорошо перемешан.
Таким образом, я несколько раз перемешаю суспензию, поднимая и опуская планшет. И, наконец, я внесу около 12 µL этой клеточной суспензии в гемоцитометр. У него есть два порта, и вы можете использовать любой из них.
Таким образом, всё, что вам нужно сделать, — это ввести раствор в этот порт, и жидкость будет втянута за счет капиллярного эффекта. Теперь я готов к подсчету. Перед нами гемоцитометр при 10-кратном увеличении, и здесь виден квадрант, состоящий из 16 квадратов.
Как видите, здесь мы можем наблюдать живые и мертвые клетки. Вот живые клетки, например эта, эта и эта. А также есть некоторые мертвые клетки, как эта.
Как вы заметили, мертвая клетка выглядит темно-синей, в то время как вокруг живых клеток наблюдается своего рода ореол. Теперь я приступлю к подсчету всех живых клеток, двигаясь слева направо и сверху вниз.
1, 2, 3, 4, 5, 6, 33, 1 32, 33, 34, 3 5, 3 6. Таким образом, в этом квадранте всего тридцать шесть клеток. Чтобы обеспечить согласованность подсчета, когда я вижу клетки, находящиеся на границе квадранта, например, вдоль этой линии, я считаю клетки, расположенные на левой и верхней границах.
Я последовательно подсчитываю клетки на этих границах для всех квадрантов гемоцитометра. Теперь мы рассчитаем количество клеток на микролитр. Для этого я возьму среднее количество клеток на квадрант, которое составляет 38, и умножу его на 10 — коэффициент, определяемый размерами камеры.
Также мы умножим результат на 10, что в данном случае является коэффициентом разведения. В итоге мы получим количество клеток на микролитр. Таким образом, в данном примере мы имеем 3 800 клеток на µL.
Поскольку мы ресуспендировали наш осадок клеток в 500 µL раствора, вы можете рассчитать общее количество имеющихся клеток. На этом всё.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данном протоколе описан метод подсчета нейральных стволовых клеток/клеток-предшественников человека (hNSPCs) с помощью гемоцитометра. В нем подчеркивается важность дифференциации живых и мертвых клеток для различных целей культивирования тканей.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейронаука
- Клеточная биология
- Культивирование тканей
Теоретическая база
- Подсчет жизнеспособных клеток имеет решающее значение для манипуляций с культурами тканей.
- Живые клетки способны исключать определенные красители, в то время как мертвые — нет.
- Гемоцитометр является стандартным инструментом для подсчета клеток.
- Краситель трипановый синий обычно используется для оценки жизнеспособности клеток.
Цель исследования
- Обеспечение надежного метода подсчета hNSPCs.
- Эффективная дифференциация живых и мертвых клеток.
- Помощь исследователям в подготовке к последующим экспериментам, таким как иммунохимия или трансфекция.
Используемые методы
- Использование фазово-контрастного гемоцитометра.
- Применение красителя трипанового синего для определения жизнеспособности клеток.
- Подсчет клеток под микроскопом.
- Приготовление раствора трипанового синего и среды.
Основные результаты
- Успешное дифференцирование живых и мертвых клеток.
- Точный количественный учет hNSPCs.
- Демонстрация эффективности красителя трипановый синий.
- Подтверждение гемоцитометра как надежного метода подсчета.
Выводы
- Данный протокол предлагает простой способ подсчета клеток.
- Он применим к различным типам клеток, помимо hNSPCs.
- Понимание жизнеспособности клеток имеет важное значение для успешного проведения экспериментов по культивированию тканей.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для отрасли
Точный количественный анализ жизнеспособных стволовых клеток-предшественников нейронов человека (hNSPCs) необходим для обеспечения воспроизводимости рабочих процессов культивирования тканей при поиске новых лекарственных средств в нейробиологии. Данный протокол позволяет надежно оценивать жизнеспособность и измерять концентрацию клеток, что обеспечивает единообразие посева для последующих приложений, таких как иммуноцитохимия и трансфекция. Благодаря стандартизации дифференциации живых и мертвых клеток с помощью трипанового синего и подсчета на гемоцитометре, этот метод повышает достоверность прогнозов на ранних этапах валидации мишеней и разработки аналитических систем.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишени
- Научная ценность: обеспечивает точный посев hNSPCs для исследований по изучению взаимодействия с мишенями и модуляции сигнальных путей.
- Практическая ценность: снижает вариабельность анализов на основе клеточных культур за счет обеспечения постоянного количества жизнеспособных клеток на входе.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: предоставляет количественные, воспроизводимые данные о концентрации клеток, которые имеют решающее значение для стандартизации анализа.
- Практическая ценность: обеспечивает возможность масштабируемого приготовления клеточных суспензий для форматов высокопроизводительного скрининга.
Трансляционные и доклинические исследования
- Научная ценность: Обеспечивает согласованность исходного количества клеток при переходе от этапа поиска к доклиническим исследованиям.
- Операционная ценность: Способствует межфункциональному взаимодействию за счет стандартизации методов подсчета клеток.
Интеграция в конвейеры и рабочие процессы
Данный метод является частью раннего этапа разработки препаратов, обеспечивая надежную подготовку клеток на всех стадиях — от валидации мишени до оптимизации анализа и доклинического тестирования эффективности.
- Биология открытий: Обеспечивает точное дозирование клеток для экспериментов по валидации мишеней с использованием hNSPCs.
- Скрининг: Обеспечивает стандартизированный и количественно определяемый ввод клеток, необходимый для воспроизводимости результатов анализа.
- Аналитика: Позволяет получать данные о концентрации жизнеспособных клеток и их общем количестве, которые используются для нормализации условий эксперимента.
- Трансляционные исследования: Обеспечивает преемственность методов работы с клетками при переходе от исследований in vitro к доклиническим моделям.
- Корпоративное повторное использование: Представляет собой передаваемый низкозатратный метод, применимый для различных типов клеток и проектов.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышает достоверность прогнозов за счет минимизации вариабельности входных данных в экспериментах на клеточных моделях.
- Операционная ценность: Повышает воспроизводимость и стандартизацию исследований между различными лабораториями и группами.
- Стратегическая ценность: Обеспечивает принятие более обоснованных решений о продолжении или прекращении разработки благодаря надежной базе проведения анализов.
- Влияние на портфель: Позволяет осуществлять продвижение проектов с учетом рисков, обеспечивая качество данных на этапе раннего скрининга эффективности.
Особенности реализации
- Требуются базовые навыки культивирования тканей и владение методами микроскопии.
- Зависит от наличия гемоцитометра и его надлежащей очистки для предотвращения контаминации.
- Необходим постоянный инструктаж оператора для непредвзятого выбора квадрантов и соблюдения правил подсчета клеток на границах.
- Ограничено пропускной способностью ручного подсчета; не подходит для высокопроизводительной автоматизации без соответствующей адаптации.
- Основано на правильном разведении и перемешивании для обеспечения репрезентативности выборки клеточной суспензии.
