Пассирования правам нервные стволовые клетки
22 августа 2007 г.
Способность манипулировать человеческой нейронных стволовых / клеток-предшественников (hNSPCs) в пробирке позволяет исследовать их полезность в качестве клеточных трансплантатов для использования в терапевтических целях, а также изучить человеческие развития нервной системы. Этот протокол представляет метод культивирования и пассажи hNSPCs в надежде на повышение воспроизводимости человеческого исследования стволовых клеток.
Здравствуйте, меня зовут Стив. Я работаю в лаборатории доктора Фланагана на кафедре патологии Университета Калифорнии в Ирвайне. Сегодня я покажу вам, как проводить пассирование (разделение) нейральных стволовых клеток человека.
Данная методика включает в себя покрытие нового флакона раствором фибронектина человека, отделение клеток с помощью буфера для диссоциации клеток, последующую нейтрализацию буфера раствором 10% сыворотки, центрифугирование клеточной суспензии, повторное суспендирование клеток в свежей среде и перенос клеточной суспензии в новый флакон. В нашей лаборатории мы культивируем нейральные клетки-предшественники человека, заменяя половину среды через день, и проводим пассирование примерно раз в неделю с разделением в соотношении от 1:2. При пассировании клеток я могу провести их подсчет, если планирую использовать их для иммунохимического эксперимента или для трансфекции ядерным эффектором.
При подготовке клеток к упаковке важно использовать буфер для диссоциации клеток, поскольку, в отличие от трипсина, он не содержит ферментов и действует гораздо мягче. Здравствуйте, сейчас мы находимся в помещении для культивирования тканей, и прежде чем я покажу вам, как выглядит колба с конфлюэнтными клетками-предшественниками человека, я подготовлю оборудование для культивирования. Сначала я выключу УФ-лампу, а затем включу освещение и подачу воздуха.
Далее я продезинфицирую вытяжной шкаф 70% ethanol, смочив бумажное полотенце и протерев поверхности шкафа. Важно распылять 70% ethanol на бумажное полотенце, а не непосредственно внутрь шкафа, так как прямое распыление 70% ethanol может повредить дорогостоящий HEPA-фильтр. Затем я обработаю спреем все реагенты и инструменты.
И наконец, я обработаю вакуумные шланги спреем, и на этом всё. Давайте посмотрим на эти клетки. Видно, что данные клетки достигли примерно 80% конфлюэнтности.
Это нейральные клетки-предшественники человека, выделенные из плодов человека; мы выращиваем их в колбах T 25. Мы проводим пассирование клеток примерно раз в неделю с коэффициентом разведения от 1:2. Теперь я готов к пассированию своих клеток.
Сначала я возьму новый флакон T 25, который я предварительно покрывал человеческим фибронектином от BD biosciences в течение четырех часов. Я удалил раствор фибронектина. Теперь я промою этот флакон раствором BBS перед тем, как перенести в него клетки.
Теперь я достану клетки из инкубатора, установленного на 37 °C. Вот они. Теперь я удалю промывочный раствор PBS из нового флакона, который был покрыт человеческим фибронектином.
Затем я добавлю два миллилитра старой кондиционированной среды в новый флакон. Теперь мне необходимо промыть клетки PBS, прежде чем снимать их с поверхности. Сначала я удалю остатки среды и сразу добавлю около двух мл PBS, чтобы клетки не пересохли.
Я подожду около двух минут перед удалением PBS и добавлением буфера для диссоциации клеток, чтобы удалить остатки клеток с поверхности флакона. Теперь я удалю PBS и снова постараюсь сразу добавить буфер для диссоциации клеток, чтобы они не пересохли. Я добавлю 1,5 мл буфера для диссоциации клеток.
В отличие от использования PBS, я добавлю этот раствор непосредственно на клетки, стараясь покрыть как можно большую площадь поверхности. Поэтому я перемещаю флакон из стороны в сторону, медленно добавляя буфер к клеткам. Теперь я подожду около пяти минут, чтобы клетки начали отделяться от поверхности.
Я оставлю колбу при комнатной температуре в вытяжном шкафу. Как здесь видно, клетки сначала начинают округляться, а затем начинают отделяться от поверхности; фактически уже можно заметить некоторые плавающие клетки. Если слегка постучать по боковой стенке колбы, это поможет им отделиться.
Прошло пять минут, и, как вы видите, раствор стал очень плотным за счет клеток, отделившихся от поверхности. Теперь я нейтрализую действие буфера для диссоциации клеток, добавив 4,5 мл среды, содержащей сыворотку. Я буду использовать 10% термоинактивированную фетальную бычью сыворотку в среде DMEM-F12; я добавлю ее непосредственно на поверхность флакона, чтобы убедиться, что прикрепленные клетки отсутствуют.
Затем я буду аккуратно пипетировать раствор вверх-вниз, чтобы resuspended остатки клеток. После этого я перенесу клеточную суспензию в коническую пробирку объемом 15 мл и центрифугирую её при 1000 RPM в течение одной минуты.
Центрифугирование клеток завершено, и перед нами образовался четкий клеточный осадок. Я очень осторожно удалю сывороточную среду, стараясь не потревожить осадок. Затем я ресуспендирую осадок в 4 мл среды.
Теперь я постараюсь ресуспендировать осадок так, чтобы в растворе не осталось комков клеток, чтобы он стал гомогенным и не содержал включений. Поскольку я провожу пассаж в соотношении 1:2, я возьму 2 мл из 4 мл суспензии и перенесу их в новый флакон, в котором уже находится 2 мл кондиционированной среды. В завершение я подпишу флакон, указав тип клеток, номер пассажа и дату.
Перед нами клетки, которые мы пересадили полчаса назад. Как видно, большинство из них прикрепились к поверхности и начали формировать отростки. На этом всё.
Теперь я готов приступить к подсчету.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данном протоколе описан метод культивирования и пассирования стволовых клеток-предшественников нейронов человека (hNSPCs) in vitro. Эта методика направлена на повышение воспроизводимости исследований стволовых клеток человека и облегчение изучения развития нервной системы и возможных терапевтических применений.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Биология стволовых клеток
- Методы культивирования клеток
Теоретическая часть
- Стволовые клетки-предшественники нейронов человека (hNSPCs) имеют решающее значение для изучения развития нервной системы.
- Манипуляции с hNSPCs in vitro могут привести к терапевтическим достижениям.
- Воспроизводимость исследований стволовых клеток необходима для научного прогресса.
- Методы культивирования клеток являются фундаментальными в нейробиологических исследованиях.
Цель исследования
- Обеспечить надежный метод культивирования hNSPCs.
- Облегчить использование hNSPCs в экспериментальных исследованиях.
- Углубить понимание развития нервной системы человека.
Используемые методы
- Покрытие колб человеческим фибронектином.
- Использование буфера для диссоциации клеток для их открепления.
- Нейтрализация буфера для диссоциации раствором сыворотки.
- Центрифугирование и ресуспендирование клеток в свежей среде.
Основные результаты
- Успешный пассаж hNSPCs с использованием описанного метода.
- Повышение воспроизводимости методов культивирования клеток.
- Потенциал для применения в иммунохимических экспериментах и опытах по трансфекции.
- Установление регламента смены среды и частоты пассажей.
Выводы
- Данный протокол предлагает систематический подход к культивированию hNSPC.
- Повышение воспроизводимости может привести к более точным результатам экспериментов.
- Дальнейшие исследования могут быть направлены на изучение терапевтического потенциала hNSPCs.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для отрасли
Стандартизированный пассаж нейральных стволовых клеток и клеток-предшественников человека (hNSPCs) обеспечивает воспроизводимость моделей in vitro для валидации мишеней и механического снижения рисков в исследованиях нейродегенеративных заболеваний. Надежная экспансия hNSPCs позволяет обеспечить стабильный входной материал для анализов при фенотипическом скрининге и программах идентификации ведущих соединений. Данный протокол направлен на устранение вариабельности в культивировании стволовых клеток, которая может исказить результаты трансляционных исследований биомаркеров и снизить точность доклинических моделей.
Стратегические применения в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет исследовать модуляцию нейронных путей с использованием генетически стабильных hNSPCs, экспрессирующих nestin и SOX2.
- Практическая ценность: снижает вариабельность, вызванную культивированием, которая затрудняет считывание показателей взаимодействия с мишенью при первичном скрининге.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: Обеспечивает получение hNSPCs с адгезивной биполярной морфологией, подходящих для высокопроизводительной визуализации роста нейритов или экспрессии синаптических маркеров.
- Практическая ценность: Стандартизированный пересев в соотношении 1:2 каждые 7 дней позволяет поддерживать масштабируемую плотность посева для анализов в многолуночных планшетах.
- Стратегическая ценность: Использование флаконов с покрытием из фибронектина повышает эффективность прикрепления клеток, снижая вариативность между лунками при скрининге соединений.
Трансляционные и доклинические исследования
- Научная ценность: Поддерживается экспрессия маркеров недифференцированных клеток, что сохраняет мультипотентность для последующей дифференцировки в нейрональные подтипы, имеющие значение для изучения конкретных заболеваний.
- Практическая ценность: Перенос кондиционированной среды во время пассирования позволяет проводить исследования паракринных факторов, значимых для нейровоспалительных путей.
Интеграция конвейера и рабочего процесса
Данный метод пассирования вписывается в непрерывный процесс исследования — от валидации мишени и оптимизации анализа до создания доклинических моделей, при этом единообразие hNSPC влияет на достоверность данных на всех этапах.
- Фундаментальная биология: обеспечивает проверку гипотез посредством контролируемой экспансии hNSPCs для CRISPR-скрининга или исследований сверхэкспрессии.
- Скрининг: позволяет достигать воспроизводимой плотности посева для количественной оценки влияния соединений на жизнеспособность клеток или маркеры дифференцировки.
- Аналитика: позволяет получать гомогенные суспензии, подходящие для проточной цитометрии или иммуноцитохимического анализа для получения количественных данных.
- Трансляционные исследования: связывают методику с доклинической работой, обеспечивая масштабируемый источник получения нейронов или глии для исследований эффективности трансплантации.
- Корпоративное использование: определенные параметры покрытия и частота пассажей позволяют осуществлять трансфер технологии между разными площадками в рамках многопроектных программ по стволовым клеткам.
Операционное и корпоративное влияние
- Научная ценность: Повышение прогностической достоверности анализов на основе стволовых клеток за счет минимизации дрейфа, вызванного пассированием.
- Операционная ценность: Стандартизированные этапы диссоциации и нейтрализации повышают воспроизводимость результатов от дня к дню.
- Стратегическая ценность: Обеспечивает экономически эффективное масштабирование за счет сокращения количества неудачных партий, вызванных нестабильным субкультивированием.
- Влияние на портфель: Поддерживает принятие решений с учетом рисков в портфелях исследований нейродегенеративных заболеваний путем повышения точности данных в каскадах валидации мишеней.
Особенности реализации
- Требуется обучение методам асептической работы для безопасного обращения с буферами для диссоциации и сывороточными добавками.
- Необходимо наличие культуральной посуды, покрытой фибронектином человека, и стерильных конических пробирок для центрифугирования.
- Требуется стандартизация времени пассирования относительно степени конфлюэнтности (~80%) во избежание дифференцировки, вызванной избыточным разрастанием клеток.
- Переход к суспензионным или сфероидным культурам потребует корректировки матрицы, помимо адгезивного покрытия фибронектином.
- Ограничено масштабами научно-исследовательских работ; пассирование в соответствии с требованиями GMP потребует использования биореакторов закрытого типа и квалифицированных реагентов.
