Связанные хромосомы Ловушка для выявления дальних взаимодействий ДНК

Общая цель следующего эксперимента заключается в обнаружении и идентификации ассоциированных партнеров ДНК на больших расстояниях. Это достигается путем фиксации, лизиса клеток и переваривания ДНК первым рестрикционным ферментом с последующим лигированием для создания химерной ДНК, состоящей из сегментов двух ассоциированных генов. Далее к химерной ДНК после второго рестрикционного переваривания добавляются линкеры. Для облегчения амплификации затем проводится ПЦР-амплификация с использованием праймеров, специфичных к линкеру и приманке (bait) ДНК, чтобы получить достаточное количество ассоциированных фрагментов ДНК. В результате на основе анализа последовательности амплифицированных фрагментов ДНК выявляются партнеры ДНК, ассоциированные с приманкой на больших расстояниях.

Основное преимущество данного метода перед существующими способами, такими как захват подтверждения хромосом или 3C, заключается в том, что A-C-T-S-A может быть эффективно использован для идентификации неизвестного удаленного ассоциированного партнера по ДНК. В то время как метод 3C был разработан только для проверки ранее предполагаемых взаимодействий. Чтобы приступить к данному протоколу, культивируйте клетки человека в инкубаторе с 5% carbon dioxide при 37 °C до достижения 80–90% конфлюэнтности.

Для данной демонстрации используются клетки острого промиелоцитарного лейкоза человека. Соберите клетки, перенеся их в пробирку NOC объемом 50 миллилитров, и центрифугируйте при 1200 об/мин в течение 15 минут. После центрифугирования удалите среду путем аспирации.

Добавьте 5 мл культурной среды для ресуспендирования осадка клеток. После подсчета клеток с помощью гемоцитометра возьмите примерно 1 × 10⁷ клеток и доведите объем до 40 мл с помощью среды RPMI 1640, содержащей 10% FBS. Затем добавьте 1,7 мл 37% формальдегида для фиксации разбавленного хроматина.

Инкубируйте образец при комнатной температуре в течение 10 минут при осторожном перемешивании. После инкубации остановите реакцию, добавив 2,4 миллилитра двухмолярного глицина. Затем центрифугируйте образец в течение 15 минут при 1200 RPM и четырех градусах celsius.

После удаления супернатанта один раз промойте осадок 40 миллилитрами ледяного PBS, затем центрифугируйте образец, чтобы получить промытый осадок клеток. Ресуспендируйте полученный осадок в 40 миллилитрах ледяного лизирующего буфера со свежедобавленными ингибиторами протеаз и 0,1 миллимоляр PMSF. Инкубируйте образец в холодильной комнате при перемешивании в течение 90 минут. Наконец, центрифугируйте образец при 2 500 RPM в течение 15 минут, удалите супернатант и получите изолированные ядра. Ресуспендируйте ядра в 0,5 миллилитрах одного XNEB буфера три и добавьте 15 микролитров 10% SDS.

Инкубируйте образец при 37 °C в течение одного часа при перемешивании. Затем добавьте 45 µL 20% Triton X 100 для секвестрации SDS и снова инкубируйте при 37 °C в течение одного часа при перемешивании и разделите на аликвоты по 1 × 10⁶. Для расщепления рестрикционными ферментами к 55 µL раствора ядер используют ядра в количестве примерно 15 µg.

Добавьте 433 µL 1X буфера NEB 3 и 12 µL BGL 2. Для достижения общего объема реакции рестрикции 500 µL инкубируйте смесь при 37 °C в течение ночи. На следующий день инактивируйте рестрикционный фермент, добавив 95 µL 10% SDS, и денатурируйте фермент, нагревая смесь при 65 °C в течение 20 минут.

В водяной бане добавьте 7 мл 1x лигазного буфера и 360 µL 20% Triton X 100. Инкубируйте образец при 37 °C в течение одного часа. Снизьте температуру до 16 °C и добавьте 50 µL раствора с концентрацией 400 units/µL.

Т4 ДНК-лигаза. Инкубируйте реакционную смесь для лигирования при 16 °C в течение четырех часов, а затем при комнатной температуре в течение 30 минут. По завершении лигирования добавьте 300 µg протеиназы K и инкубируйте при 65 °C в течение ночи.

Затем добавьте 5 µg RNAA и инкубируйте при 37 °C в течение 30 минут. Очистите ДНК с помощью фенол-хлороформной экстракции и осадите ДНК изопропанолом, после чего растворите осадок ДНК в 150 µL стерильной дистиллированной воды. Для лигирования линкеров к химерной ДНК сначала проведите рестрикцию ДНК, инкубируя 2 µg очищенной ДНК с 5 единицами MspI при 37 °C в течение 4–6 часов; после рестрикции инактивируйте MspI при 65 °C в течение 10 минут.

Затем осадите ДНК этанолом с добавлением 1 µL гликогена в концентрации 5 mg/mL. Растворите полученный осадок ДНК в 50 µL стерильной дистиллированной воды. Далее смешайте 50 µL ДНК, обработанной MSP1, с 2 µL линкерного олигонуклеотида L в концентрации 20 µM и 1 µL олигонуклеотида S в концентрации 20 µM, затем добавьте 1 µL стерильной дистиллированной воды и 6 µL 10X буфера для ДНК-лигазы T4.

Покройте смесь жидким воском. Денатурируйте олигонуклеотиды при 50 °C в течение одной минуты, затем постепенно охладите до 10 °C с градиентом 0,5 °C в минуту. С помощью термоциклера добавьте 1 µL T4 ДНК-лигазы в концентрации 400 units/µL и инкубируйте реакционную смесь при 15 °C в течение ночи.

На следующий день очистите лигированную ДНК с линкером с помощью набора для быстрой очистки ПЦР-продуктов Kaya и элюируйте в 50 µL стерильной дистиллированной воды. Выберите праймер для специфического участка ДНК, который будет исследован на наличие дальних взаимодействий. В данном примере в качестве праймера или «приманки» будет использоваться Abel.

Подготовьте очищенную ДНК для первого раунда ПЦР, смешав 1 µL очищенной ДНК с 1 µL 20 µM специфического праймера able 46 56 и 1 µL 20 µM специфического линкерного праймера 29 63. Затем добавьте 3 µL 3x коктейля ClinTech DNA polymerase I, предварительно смешанного с 32 P-D-C-T-P согласно письменному протоколу, и 3 µL стерильной дистиллированной воды. Проведите ПЦР-амплификацию, используя цикл термоциклирования ПЦР с «горячим стартом» (hot start), описанный в письменном протоколе.

Очистите продукты первого раунда ПЦР с помощью набора для быстрой очистки ПЦР-продуктов Kaya Quick PCR Purification Kit. Элюируйте их в 30 µL стерильной дистиллированной воды. Используйте 1 µL продукта первой ПЦР, разведенного в 100 раз, для проведения второго раунда ПЦР с использованием вложенных праймеров, добавив 1 µL 20 µM специфичного праймера able one (46 26) и 1 µL 20 µM специфичного праймера linker (29 61).

Снова добавьте 3 µL 3x ClinTech, DNA polymerase, one cocktail и 3 µL стерильной дистиллированной воды. Проведите второй раунд ПЦР, используя следующий режим термоциклирования: 25 циклов, включающих 95 °C в течение 20 секунд, 67 °C в течение 40 секунд и 72 °C в течение одной минуты, с последующей достройкой при 72 °C в течение пяти минут.

Визуализируйте продукты ПЦР, используя ПААГ с 5% мочевиной, с последующим сканированием экспонированного экрана на фосфоримейджере. Каждую полосу ПЦР можно извлечь из геля, растворив полоски геля в микроцентрифужной пробирке, содержащей 60 µL стерильной дистиллированной воды, и инкубировав при 95 °C в течение пяти минут. Кратковременно центрифугируйте растворенные продукты геля при 10 000 об/мин в течение 10 секунд.

Соберите все образцы. Отберите 1 µL для использования в качестве матрицы ДНК при проведении ПЦР с праймером для репарации. 29 61 46 26.

При соблюдении тех же условий, что описаны выше, после очистки и секвенирования можно воспользоваться онлайн-инструментом для определения хромосомной локализации. На биоинформационном ресурсе по геному нажмите blatt, чтобы открыть новое окно, и вставьте последовательность ДНК. После отправки последовательности ДНК появятся результаты поиска BLATT.

Нажмите «browser» на результате со 100% идентичностью, чтобы определить местоположение последовательности ДНК. Регион able one был использован в качестве приманки для определения его дальних взаимодействий с ДНК. Для анализа A CT были выбраны два сайта BGL II и один сайт BamH I; во втором раунде ПЦР набор праймеров 46 26 29 61 использовался для амплификации able M1, 46 30 29 61 — для able M2, а 46 36 29 61 — для able M3.

Типичная картина электрофореза в геле выявляет от одной до нескольких полос, как показано здесь для able M1, able M two и able M three. Последовательность ДНК клона able M1 представлена для того, чтобы продемонстрировать, что каждый фрагмент из анализа A CT состоит из двух объединенных сегментов ДНК. Один сегмент происходит из области ДНК-приманки, а второй — от соответствующего партнера.

Сегменты соединяются друг с другом с помощью первой последовательности распознавания рестрикционного фермента. Вторая последовательность распознавания фермента будет находиться в конце соответствующей партнерской последовательности. Клонируемый фрагмент M1 содержит ДНК области ABLE one, расположенной в локусе 9q32.4 хромосомы 9, а соответствующий партнер расположен в локусе 3p3 хромосомы 3 и был идентифицирован как proc two.

Аналогично, ассоциированный партнер able M two был локализован в хромосоме пять Q 21.1, в то время как клон able M three был идентифицирован как внутрихромосомная ассоциация вблизи локуса ABLE one, в отличие от анализов three C. Методика, описанная в данном видео, позволяет выявить наиболее распространенные дальние взаимодействия. Однако путем увеличения количества циклов ПЦР можно также идентифицировать дополнительные, менее частые ассоциации; при использовании импринтинга и контрольного региона или ICR в локусе IGF two H 19 в качестве ДНК-приманки в клетках фибробластов мыши в первом и втором раундах ПЦР в анализе A CT применялись различные программы циклирования.

Метод A CT также может быть использован для выявления различий в архитектуре ядра и дальнодействующих взаимодействиях между нормальными клетками и раковыми клетками. Была проведена гомогенизация нормальной ткани толстой кишки и ткани рака толстой кишки, после чего был выполнен анализ A CT согласно описанным здесь процедурам. Здесь представлена структура ДНК региона ICR в локусе IGF two H 19 и гена IGF two dpn.

Два участка для анализа A CT; праймеры с метками, используемые во втором раунде ПЦР, обозначены стрелками и цифрами разных цветов. Картина электрофореза в геле для анализа A CT представляет результаты ПЦР с использованием праймера 29 61 в сочетании с парами праймеров 41, 61, 41 63, 51 45 и 51 51. Уникальные полосы, которые появляются только в нормальной ткани толстой кишки, отмечены желтыми стрелками, а полосы, появившиеся только в ткани рака толстой кишки после разработки метода, отмечены красными стрелками.

Этот метод открывает перед исследователями в области молекулярной биологии возможности для изучения архитектуры ядра и регуляции генов в трехмерном пространстве.