Высокая пропускная способность физического картирования хромосом использованием автоматизированных
28 июня 2012 г.
Сборки геномов, основанные на технологиях массивно-параллельного секвенирования ДНК, обычно сильно фрагментированы. Разработка физических карт хромосом может потенциально улучшить сборки геномов. В данной работе мы демонстрируем инновационные подходы к подготовке хромосом, флуоресцентной гибридизации in situ и визуализации, которые значительно увеличивают пропускную способность процесса создания физических карт.
Общая цель данной процедуры заключается в картировании ДНК-зондов на политенных хромосомах комаров с использованием метода приготовления хромосом под высоким давлением с последующей автоматизированной гибридизацией in situ с флуоресценцией и автоматизированной визуализацией. Сначала подготавливают препараты политенных хромосом методом высокого давления. Следующим этапом процедуры является подготовка флуоресцентных зондов путем маркировки геномной ДНК флуорохромом с использованием протокола ник-трансляции.
Третьим этапом является проведение флуоресцентной гибридизации in situ с использованием автоматизированных систем окрашивания предметных стекол. Заключительным этапом является сканирование и фотографирование меченных хромосом с помощью автоматической системы флуоресцентной визуализации. В итоге полученные изображения позволяют определить локализацию флуоресцентно меченного ДНК-зонда на полихросоме.
Главным преимуществом данной методики по сравнению с существующими методами, такими как стандартный протокол ручной гибридизации in situ, является то, что высокопроизводительный протокол физического картирования обеспечивает более стабильные результаты и значительно сокращает время непосредственной работы. Данный протокол начинается с препарирования самок через примерно 25 часов после кровососания для сбора яичников на третьей стадии развития по Кристоферу. На этой стадии прозрачная область с трофическими клетками внутри фолликулов должна иметь округлую форму; соберите яичники пяти самок и зафиксируйте их в 500 µL свежеприготовленного модифицированного раствора Карнуа.
Затем их можно хранить при комнатной температуре до 24 часов или дольше при температуре -20 °C. Далее, непосредственно перед приготовлением препаратов для диссекции яичников, подготовьте раствор Carnoy и 50% пропионовую кислоту. Поместите каждую пару яичников в каплю свежего раствора Carnoy на безпыльное предметное стекло под диссекционным микроскопом.
Разделите яичники с помощью диссекционной иглы. Перенесите все фрагменты яичников на шесть чистых предметных стекол с 50% пропионовой кислотой. Разделите фолликулы друг от друга, используя диссекционные иглы.
Затем удалите остатки тканей бумажным полотенцем. Добавьте еще одну каплю 50% пропионовой кислоты и подождите от трех до пяти минут. Примечание: выдерживание фолликулов в 50% пропионовой кислоте в течение трех-пяти минут значительно улучшает разброс хромосом.
Затем накройте образец покровным стеклом и подождите еще одну минуту, чтобы ядра распределились. Оберните предметное стекло фильтровальной бумагой и пластиком. Установите скорость Dremel в диапазоне от 3 000 до 5 000 об/мин и в течение примерно одной минуты осторожно вращайте наконечником Dremel по покровному стеклу.
Проверьте качество разворота под фазово-контрастным микроскопом и, при необходимости, продолжите обработку дремелем для более полного распластывания хромосом. Поместите второе покровное стекло рядом с первым, затем зафиксируйте покровные стекла с помощью другого микроскопа. Затем оберните предметные стекла пластиковым листом и фильтровальной бумагой, поместите обернутые стекла в тиски и зажмите их с усилием от 85 до 120 дюймо-фунтов.
После распластывания хромосом на всех шести предметных стеклах, снимите обертки и уберите лишние стекла для дальнейшего распластывания хромосом. Инкубируйте стекла при температуре 55 °C в течение 10–15 минут в системе денатурации и гибридизации предметных стекол. Затем погрузите стекло в жидкий азот минимум на 15 секунд или до прекращения пузырьков.
Затем быстро снимите покровное стекло с помощью лезвия бритвы и немедленно поместите предметное стекло в холодный 50% ethanol на пять минут. Повторите эту процедуру для каждого предметного стекла последовательно. Дегидратируйте стекла в ваннах с 70%, 90% и 100% ethanol.
Погрузите их в каждую ванночку на пять минут. В завершение, после высыхания предметных стекол на воздухе, они будут готовы к окрашиванию. Автоматическое устройство выполняет большинство этапов процедуры, за исключением маркировки зонда.
Перед загрузкой устройства подготовьте флуоресцентный зонд, пометив обратную ДНК флуорохромом согласно коммерческому протоколу трансляции NIC. После подготовки зонда поместите предметные стекла и реагенты в автоматизированную систему окрашивания стекол и запрограммируйте систему на выполнение следующих этапов. Сначала подайте 800 µL 1X PBS на 20 минут.
Во-вторых, высушите предметные стекла феном. В-третьих, зафиксируйте стекла, добавив 450 µL 4% формалина в 1XPBS на одну минуту. Затем промойте стекла 100% этанолом дважды по одной секунде и один раз в течение двух минут.
После этаноловой ванны снова просушите предметные стекла струей воздуха. Затем прогрейте стекла при 45 °C в течение двух минут, чтобы избежать образования пузырьков. После этого нанесите 20 µL ДНК-зонда, затем каплю минерального масла и накройте покровным стеклом; далее подвергните хромосомы воздействию температуры 90 °C в течение 10 минут.
Затем инкубируйте стекла для гибридизации при 42 °C в течение 14 часов. После гибридизации проведите промывки строгости в течение двух минут при 42 °C, затем четыре раза последовательно нанесите 2X SSC на одну секунду и высушите. После этого дважды нанесите 800 µL 0,4X SSC при 42 °C на 10 минут, затем проведите еще одну промывку и обработку 2X SSC при 25 °C в течение 10 минут.
Теперь нанесите краситель: 50 µL YOYO-1, затем минеральное масло и накройте покровными стеклами. Инкубируйте предметные стекла при 25 °C в течение 10 минут. Затем снимите покровные стекла.
Промойте стекла в двух растворах XSSC четыре раза по одной секунде за одну промывку и просушите их струей воздуха. В завершение нанесите 15 µL реагента Prolong Gold anti-fade на каждое стекло и закройте их новыми покровными стеклами. Включите автоматизированную сканирующую систему Accord Plus, начав с блока питания Olympus U-R-F-L-T для галогенной лампы.
Затем компьютер и, наконец, микроскоп с камерой. Теперь запустите программный пакет duet, установите предварительное сканирование с увеличением 10x. Нажмите кнопку online, введите новый идентификатор случая (case ID) и назначьте идентификатор слайда (slide id).
Нажмите на точку с надписью bf. Это опция светлого поля. В выборе сканирования выберите 10 x pre-scan.
Выберите 2 500 x круг, 10 000 x круг или прямоугольник. Нажмите «Set» (Установить) и «Run» (Запуск). Затем следуйте подсказкам, чтобы правильно настроить сканирование, и нажмите «Finish» (Готово).
Для запуска сканирования нажмите на главную вкладку, чтобы вернуться на главный экран. Теперь нажмите кнопку «offline», найдите назначенные идентификаторы случая (case ID) и слайда (slide ID), а затем нажмите «offline».
Отсканируйте область черного квадрата в верхнем левом углу. Нажмите на стрелку и выберите «10 x pre-scan». После того как будет найдено интересующее изображение, используйте стрелки для просмотра отсканированных снимков.
Дважды щелкните по экрану в центре целевой области и нажмите snap. Это позволит пометить изображение для последующего захвата после выбора всех мишеней. Щелкните правой кнопкой мыши по каждому изображению, выберите classify, затем 10 x pre-scan и выберите polytan.
Вернитесь в главное меню и настройте предварительное сканирование с увеличением 40x. Снова выберите «Online» и выберите препарат. Измените BF на ffl и измените название задачи на revisit-X40-rg.
Измените раздел непосредственно под последней настройкой на revisit dash all. Затем запустите программу и следуйте подсказкам. Чтобы настроить автоматизацию, нажмите кнопку start matching views для сопоставления изображений с увеличением 10 x и 40 x.
Нажмите «finish», чтобы начать сканирование. По завершении нажмите «classify» и просмотрите изображения. Препараты политенных хромосом питательных клеток яичника самок мухи-дрозофилы линии Gambia were made using the high pressure technique.
Этот метод не повреждает и не изменяет большинство структур хромосом. Он расправляет изогнутые хромосомы и, таким образом, выявляет скрытые тонкие полосы, которые не видны на обычных препаратах. Для зондирования хромосом использовались клоны обратной ДНК, полученные из библиотеки обратных последовательностей аномалии S Gambia nd Tam.
Библиотека была создана на основе самцов и самок личинок первой стадии звезды штамма-вредителя S Gambia. После выполнения данной процедуры можно провести автоматизированное высокопроизводительное физическое картирование для ускорения разработки сборок генома на основе хромосом.
Обзор
В данном исследовании представлен высокопроизводительный протокол картирования ДНК-зондов на политенных хромосомах комара. Благодаря использованию метода подготовки хромосом под высоким давлением и методов автоматизированной визуализации, данный способ повышает эффективность и воспроизводимость создания физических карт.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Геномика
- Картирование хромосом
- Флуоресцентная гибридизация in situ
Теоретические основы
- Сборки геномов, полученные в результате секвенирования ДНК, часто оказываются фрагментированными.
- Физические карты хромосом позволяют повысить качество сборок геномов.
- Инновационные методы могут увеличить пропускную способность при физическом картировании.
- Автоматизированные системы позволяют сократить время непосредственной работы при выполнении лабораторных процедур.
Цель исследования
- Разработать высокопроизводительный протокол картирования хромосом.
- Продемонстрировать эффективность автоматизированного получения изображений при создании физических карт.
- Повысить воспроизводимость результатов по сравнению с традиционными методами.
Используемые методы
- Приготовление препаратов хромосом из яичников комара под высоким давлением.
- Маркировка флуоресцентных зондов с использованием протокола никирования.
- Автоматизированная флуоресцентная гибридизация in situ.
- Автоматизированная визуализация для локализации хромосом.
Основные результаты
- Данный протокол позволяет получать однородные и высококачественные препараты метафазных пластинок.
- Автоматизированные системы значительно сокращают время, необходимое для физического картирования.
- Изображения эффективно демонстрируют локализацию флуоресцентно меченных ДНК-зондов.
- Данный метод повышает пропускную способность по сравнению с ручными протоколами.
Выводы
- Данный высокопроизводительный протокол представляет собой значительный прогресс в картировании хромосом.
- Автоматизация повышает эффективность и воспроизводимость физического картирования.
- Продемонстрированные методы могут быть применены в других геномных исследованиях.
Часто задаваемые вопросы
Значимость для промышленности
Высокопроизводительное физическое картирование хромосом устраняет критический пробел в качестве сборки генома, что оказывает прямое влияние на последующий геномный анализ и эволюционные исследования. Обеспечивая быструю и согласованную локализацию ДНК-зондов, данный подход позволяет снизить риски при валидации мишеней и повысить прогностическую достоверность в рабочих процессах сравнительной геномики. Интеграция средств автоматизации сокращает время ручного труда и повышает воспроизводимость, что делает этот метод масштабируемым инструментом для крупномасштабных проектов по секвенированию.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранние этапы поиска и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет исследовать архитектуру генома и уточнить локализацию генов относительно фенотипических признаков.
- Практическая ценность: снижает неопределенность при аннотации генов путем сопоставления контигов с конкретными хромосомными локусами.
- Прогностическая ценность: способствует снижению механистических рисков за счет повышения достоверности выводов о функциях генов благодаря точному физическому картированию.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: позволяет получать стандартизированные препараты метафазных пластинок хромосом с высоким разрешением, подходящие для воспроизводимых анализов методом FISH.
- Практическая ценность: автоматизированные системы окрашивания и визуализации увеличивают пропускную способность и снижают вариабельность при определении локализации зондов.
- Готовность анализа: обеспечивает получение количественных пространственных данных, позволяющих проводить сравнение различных генетических вариантов или экспериментальных условий.
Трансляционные и доклинические исследования
- Трансляционная непрерывность: облегчает эволюционный анализ и филогенетическую реконструкцию путем определения ориентации и расположения контигов секвенирования.
- Значимость для доклинических моделей: поддерживает исследования векторной компетенции, позволяя проводить сравнительную геномику видов, передающих и не передающих заболевание.
- Оптимизация с учетом рисков: повышает качество аннотации генома, сокращая количество ложноположительных результатов в конвейерах идентификации мишеней.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный метод является частью процесса исследования, начиная с первичного секвенирования генома и заканчивая аннотацией и сравнительным анализом, что особенно актуально, когда требуется разрешение физической карты для устранения пропусков в сборке или исправления ошибок сборки.
- Фундаментальная биология: способствует проверке гипотез о порядке расположения генов, синтении и хромосомной эволюции в моделях, имеющих значение для изучения заболеваний.
- Скрининг: позволяет внедрить стандартизированные автоматизированные рабочие процессы FISH для высокопроизводительной валидации зондов и скрининга их локализации.
- Аналитика: обеспечивает получение пространственных данных и показателей интенсивности, что позволяет проводить количественное сравнение связывания зондов в разных хромосомах или образцах.
- Трансляционные исследования: связывает физическое картирование с эволюционными выводами и поиском биомаркеров в исследованиях по сравнительной геномике.
- Корпоративное использование: создает многократно используемую автоматизированную платформу для физического картирования, применимую для различных видов и проектов.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: повышает достоверность прогнозирования при аннотации генов и снижает механистическую неоднозначность при интерпретации геномных данных.
- Операционная ценность: обеспечивает стандартизацию, воспроизводимость и масштабируемость за счет автоматизации этапов окрашивания, гибридизации и получения изображений.
- Стратегическая ценность: улучшает принятие решений о целесообразности дальнейших исследований при выборе мишеней за счет повышения надежности сборки генома и сокращения количества ложных биологических направлений.
- Влияние на портфель: позволяет проводить приоритизацию геномных мишеней с учетом рисков благодаря улучшению качества сборки и более глубокому пониманию эволюционных процессов.
Особенности реализации
- Требуется опыт в подготовке хромосом, протоколах FISH и работе с автоматизированными системами получения изображений.
- Зависит от наличия инструментов для подготовки под высоким давлением, автоматических окрашивателей предметных стекол и моторизованных флуоресцентных микроскопов.
- Необходима межкомандная стандартизация маркировки зондов, условий гибридизации и алгоритмов анализа изображений.
- Адаптация для различных модельных систем может потребовать оптимизации этапов распластывания хромосом и денатурации.
- Практические ограничения включают зависимость от наличия высококачественных политенных хромосом и применимость преимущественно для геномов двукрылых с политенными стадиями.
