iCLIP - транскриптома всей карты белка-РНК взаимодействия с отдельными нуклеотидных Резолюцию

Общая цель следующего эксперимента заключается в получении общетранскриптомной карты сайтов связывания РНК-связывающего белка с разрешением до одного нуклеотида. Это достигается путем УФ-облучения живых клеток для ковалентного сшивания белков и РНК in vivo на втором этапе. РНК-связывающий белок подвергается иммуноочистке в строгих условиях для выделения сшитых фрагментов РНК.

Последующая обратная транскрипция приводит к синтезу кДНК, которые часто обрываются на прикрепленном пептиде, что позволяет сохранить информацию о положении сшивки в РНК. В результате высокопроизводительного секвенирования библиотеки кДНК определяются все сайты связывания во всем транскриптоме. Данный метод позволяет ответить на ключевые вопросы биологии РНК, такие как влияние взаимодействия различных РНК-связывающих белков на регуляцию процессинга РНК. Основным преимуществом этого метода является повышение как эффективности, так и разрешения карт белково-РНК взаимодействий в масштабе всего транскриптома. Для начала процедуры УФ-сшивания подготовьте клетки культур тканей.

Удалите среду из 10-сантиметровой чашки с клетками healer. Добавьте 6 мл ледяного PBS и поместите чашки на лед. Одной чашки достаточно для трех экспериментов.

Снимите крышку и облучите клетки. После воздействия при 254 нанометрах с дозой 150 миллиджоулей на сантиметр квадратный соберите клетки, соскоблив их с планшетов с помощью клеточного скребка; перенесите по 2 мл клеточной суспензии в каждую из трех микроцентрифужных пробирок для осаждения клеток. Центрифугируйте их на максимальной скорости в течение 10 секунд при 4 °C.

Затем снимите супернатант, заморозьте осадки клеток на сухом льду и храните при температуре минус 80 °C до использования. В новую микропробирку добавьте 100 µL белковых DynaBeads на один эксперимент. Если используются антитела мыши или козы, используйте DynaBeads с белком G.

Дважды промойте гранулы лизисным буфером, состав которого указан в прилагаемом письменном протоколе. Ресуспендируйте гранулы в 100 µL лизисного буфера с добавлением от 2 до 10 µg антител. Инкубируйте пробирку при комнатной температуре в течение 30–60 минут в ротаторе.

Затем трижды промойте гранулы 900 µL лизирующего буфера и оставьте их в последней порции промывочного раствора до начала следующего этапа. Для иммунопреципитации перенесите осадок клеток Thor на лед. Ресуспендируйте его в 1 mL лизирующего буфера и перенесите в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 mL.

Приготовьте разведение RNAs one в пропорции 1:500. Затем добавьте 10 µL данного раствора вместе с двумя µL turbo DNAs в клеточный лизат. Инкубируйте образцы ровно три минуты при 37 °C при перемешивании со скоростью 1 100 об/мин, после чего немедленно перенесите на лед.

Затем центрифугируйте образцы при температуре 4 °C с ускорением 22 000 ×g в течение 20 минут для осветления лизата. Осторожно соберите супернатант, оставив около 50 µL лизата с осадком для иммунопреципитации на бусинах. Удалите промывочный буфер, затем добавьте подготовленные клеточные лизаты. Перемешивайте образцы в ротаторе в течение двух часов при температуре 4 °C.

Удалите супернатант и дважды промойте гранулы 900 мкл буфера с высоким содержанием соли, состав которого указан в прилагаемом письменном протоколе. В завершение дважды промойте гранулы 900 мкл промывочного буфера. Затем переходите к дефосфорилированию и присоединению линкера к 3'-концам РНК.

Для маркирования 5'-концов РНК работайте за защитным экраном из плексигласа. Удалите супернатант после последнего этапа промывки в реакции лигирования линкера и ресуспендируйте гранулы в восьми микролитрах горячей смеси PNK. Инкубируйте в течение пяти минут при 37 °C.

Удалите горячую смесь PNK и используйте ее повторно. Ресуспендируйте гранулы в 20 µL одного объема буфера для нанесения на гель. Затем инкубируйте образец в термомиксере при 70 °C в течение 10 минут.

Немедленно поместите образец на магнит для осаждения пустых бусин. Нанесите образцы на новый гель с концентрацией 4–12% согласно инструкциям производителя.

Также нанесите пять µL предварительно окрашенного маркера молекулярной массы белков. Проводите электрофорез в геле в течение 50 минут при 180 вольтах. Перенесите белково-РНК-комплексы из геля на нитроцеллюлозную мембрану с помощью аппарата для «мокрого» переноса NOVA в соответствии с инструкциями производителя.

После переноса промойте мембрану в PBS-буфере. Затем оберните ее пищевой пленкой Saran и подвергните экспозиции на пленке при температуре минус 80 °C. Проведите экспозицию в течение 30 минут, одного часа и в течение ночи.

Затем вырежьте из мембраны области, соответствующие белково-РНК-комплексам, ориентируясь по сигналам с низким содержанием РНК. В качестве маски используйте авторадиографию. Выделите РНК из мембраны путем переваривания протеиназой K и фенол-хлороформной экстракции.

Проведите обратную транскрипцию РНК с использованием одного из праймеров AYP для последующей очистки кДНК в геле. Смешайте 6 µL образца кДНК с 6 µL 2-кратного буфера для нанесения TBE-мочевина непосредственно перед нанесением образцов на гель.

Нагрейте образцы при 80 °C в течение трех минут. Затем нанесите образцы на готовый 6% TBE-мочевинный гель вместе с маркером низкомолекулярных белков. Проведите электрофорез в течение 40 минут при напряжении 180 вольт согласно инструкциям производителя, используя верхний краситель и метки на пластиковом основании геля для ориентирования при вырезании.

Вырежьте три полосы размером от 120 до 200 нуклеотидов, от 85 до 120 нуклеотидов и от 70 до 85 нуклеотидов. Обратите внимание, что праймер arc lip и последовательность L three вместе составляют 52 нуклеотида последовательности clip. Добавьте 400 µL TE и измельчите фрагмент геля на мелкие кусочки.

С помощью поршня шприца объемом 1 мл инкубируйте фрагменты геля при перемешивании со скоростью 1 100 об/мин в течение двух часов при 37 °C. Поместите два стеклянных фильтра-предварителя диаметром 1 см в колонку CoStar spinx. Перенесите жидкую часть образца в колонку и центрифугируйте в течение одной минуты при 13 000 об/мин в пробирку объемом 1,5 мл.

Добавьте 0.5 µL glyco blue и 40 µL ацетата натрия (pH 5.5). Затем перемешайте образец. Добавьте 1 mL 100% этанола.

Снова перемешайте и осадите образец в течение ночи при температуре -20 °C. Затем циклизируйте молекулы CD NA, чтобы присоединить адаптерную область к 5'-концу. После этого проведите релинеаризацию и ПЦР-амплификацию согласно прилагаемому письменному протоколу перед секвенированием библиотеки eye clip; успех эксперимента можно контролировать на двух этапах.

На авторадиографии комплекса белка и РНК после переноса на мембрану и на изображении геля с продуктами ПЦР в авторадиографии образцов с низким содержанием РНК должна наблюдаться диффузная радиоактивность выше молекулярной массы белка для образцов с высоким содержанием РНК. Эта радиоактивность сосредоточена ближе к молекулярной массе белка. При отсутствии антител в иммунопреципитации сигнал обнаружен быть не должен.

Дополнительные важные контроли специфичности иммунопреципитации включают либо УФ-облучение, либо использование клеток, не экспрессирующих исследуемый белок. Изображение геля с продуктами ПЦР должно демонстрировать диапазон размеров, соответствующий фракции кДНК. Обратите внимание, что праймеры для ПЦР, P three Celexa и P five Celexa, добавляют дополнительные 76 нуклеотидов к размеру кДНК. Если при иммунопреципитации антитела не используются, соответствующий продукт ПЦР обнаружен быть не должен.

При выполнении данной процедуры важно помнить, что каждый из 64 этапов является критическим и должен быть выполнен со стопроцентной точностью. Данные ICL могут быть вычислительно интегрированы с функциональными анализами по всему транскриптому. Это может, например, дать представление о зависимости регуляции процессинга РНК от положения.

Для проведения вычислительного анализа данных мы рекомендуем обратиться к нашим недавним публикациям, подготовленным в сотрудничестве с Николасом KA из Европейского института биоинформатики и Бла Зупаном из Университета Лианы. А теперь пришло время приступить к проведению ваших собственных экспериментов. Желаем успехов.