Липидов везикул-опосредованной аффинной хроматографии с использованием магнитных Активированный сортировки клеток (LIMACS): новый метод для анализа Белково-липидные взаимодействия

Данный эксперимент предназначен для идентификации липидсвязывающих белков и анализа взаимодействия липидов с белками в определенной мембранной среде из липидных везикул. Белки клеточного гомогената инкубируют со свежеприготовленными липидными везикулами из фосфатидилсерина и церамида. Затем в реакционную смесь добавляют магнитные бусины, конъюгированные с Xin V, чтобы закрепить белки, связанные с липидными везикулами, на магнитных бусинах. Далее проводят очистку белково-липидных везикул методом магнитной активации сортинга клеток.

Для подтверждения результатов по идентификации липид-связывающих белков используйте вестерн-блоттинг с SDS-PAGE, чтобы продемонстрировать очистку эндогенной и рекомбинантной атипичной PKC, а также специфического церамид-связывающего домена, экспрессированных в клетках MDCK. Основное преимущество этого нового метода перед существующими подходами, такими как ELISA или поверхностный плазмонный резонанс, заключается в том, что взаимодействие липида с белком происходит в мембраноподобной среде, а связывающие белки могут быть очищены и проанализированы. Значение данного метода распространяется на терапию и диагностику заболеваний, связанных с нарушением липидного обмена, поскольку при таких патологиях физиологическое взаимодействие липидов с белками нарушено.

Для некоторых из этих заболеваний белковые мишени даже не известны и требуют идентификации. Для разработки терапии на основе липидов начните с приготовления больших однослойных липосом (SLE) из высушенной смеси эквимолярных количеств фосфатидилсерина и церамида C16 в 100 µL сикального буфера. Добавьте 300 µL сикального буфера, содержащего 0,1 мМ хлорида марганца, и подвергните образцы соникации в течение одного часа. Центрифугируйте образцы при 12 000 ×g в течение 20 минут при 4 °C, затем ресуспендируйте осадок больших липидных везикул в 100 µL сикального буфера. Добавьте 1 нМ флуоресцентного красителя Vybrant CM-DiI и инкубируйте при 37 °C в течение одного часа для облегчения визуализации фракции SLE. После магнитного разделения соберите розовый осадок окрашенных Vybrant CM-DiI фосфатидилсерин-церамидных SLE путем центрифугирования и ресуспендируйте их в 100 µL Трис-буфера.

Затем для подготовки клеточного лизата, не содержащего детергентов, подвергните клетки соникации в 300 µL гипертонического буфера (10 mM Tris-HCl), содержащего ингибиторы протеаз и фосфатаз, и центрифугируйте. Чтобы удалить мембранные остатки, добавьте прозрачный клеточный лизат в физическую суспензию липидов и инкубируйте смесь в течение двух часов при 4 °C. Поскольку клеточные лизаты могут содержать эндогенные мембраны с фосфатерином, рекомендуется очистить лизат от этих мембран путем дополнительных этапов центрифугирования.

Добавьте в реакционную смесь 20 µL буфера для связывания XNV и 50 µL раствора, содержащего магнитные бусины, конъюгированные с XNV; инкубируйте в течение одного часа при 4 °C, затем проведите магнитную сепарацию клеток (MACS) согласно протоколу производителя. Далее с помощью микропланшетного флуориметра измерьте интенсивность флуоресценции CM DII в проточной и элюируемых фракциях, чтобы определить наличие и количество липидных везикул в анализе конкурентного связывания антител. Для проверки специфичности реакции связывания A PKC с везикулами церамид-фосфосерина инкубируйте 1 µg кроличьих поликлональных антител к anti P KC Zeta с клеточным лизатом в течение одного часа при 4 °C, после чего проведите инкубацию с липидными везикулами.

Переходите к электрофорезу в ПААГ-SDS и иммуноблоттингу для анализа связывания белка с остатками фосфатидилсерин-церамида в максимальном элюате при восстановлении комплекса полярности липид-белок in vitro. Начните с подготовки розового осадка везикул фосфатидилсерин-церамида, окрашенных красителем vibrant cm DII, как показано ранее; ресуспендируйте везикулы в 100 µL TRI-буфера, дополненного 100 µM gamma S GT P, 1 mM GDP и смесью рекомбинантных белков, представляющих интерес. Затем инкубируйте реакционную смесь при 4 °C в течение трех часов. Далее добавьте 5 µL 20-кратного стокового раствора буфера X in V и 50 µL магнитных бусин, конъюгированных с X in V.

Инкубируйте смесь при осторожном перемешивании еще в течение 30 минут при температуре 4 °C. Продолжите выполнение магнитной сортировки активированных клеток NX NV в соответствии с протоколом производителя для облегчения осаждения. Добавьте в элюционную фракцию 10 µg чистого альбумина.

Концентрируйте белки методом осаждения по Уэйлу и Флю. Нижняя фаза состоит из смеси хлороформа и метанола с обогащенным vibrant cm dii. Коричневатая интерфаза содержит магнитные бусины и осажденный белок.

Количественно определите липидные везикулы путем детектирования ярко-розового красителя cm dii в органической фазе хлороформ-метанол в результате реакции Вейля-Флу. Используйте равные количества липидных везикул для нормализации содержания белка в образцах и проведите анализ с помощью SDS-PAGE и иммуноблоттинга.

Бесдетергентный лизат клеток MDCK, экспрессирующих полноразмерный PKC Zetta, С-конец которого связан с зеленым флуоресцентным белком или керамид-связывающим доменом. С-конец pkc. Zetta инкубировали с фосфосерином.

После элюции из колонки с керамидными везикулами белки анализировали методом иммуноблоттинга. Фрагмент C20 Zeta, связывающий керамид, EGFP и полноразмерный PKC Zeta были обнаружены в элюате колонки, что подтверждает специфичность и эффективность процедуры лизиса. Отрицательный контроль EGFP, который не связывался с керамидными везикулами сирийского хомяка, в элюате не обнаруживался.

При сочетании метода Linx с другими методами, такими как SDS-ПААГ, вестерн-блоттинг или протеомный анализ, можно получить ответы на дополнительные вопросы, например, о том, какие белки входят в состав липидсвязывающего белкового комплекса. После своей разработки LabX открыла исследователям в области изучения единичных липидов путь к изучению церамид-индуцированного апоптоза и полярности клеток в нейростволовых и эпителиальных клетках.