ampliPHOX Колориметрические обнаружения на ДНК-микрочипов по гриппу

Общая цель следующего эксперимента заключается в использовании нового экспресс-метода усиления сигнала для обнаружения и характеристики подтипов вируса гриппа на платформе микрочипа для гриппа с низкой плотностью микромассива. Это достигается путем включения биотинилированных DTP и использования праймеров с фосфоротиоатным концом в положении 5' для амплификации сегмента матриксного гена и сегмента неструктурного гена из экстрактов РНК вируса гриппа. После ПЦР проводится ферментативное переваривание и фрагментация для получения коротких одноцепочечных биотинилированных и амплифицированных вирусных продуктов, которые затем гибридизуются с микромассивом после этапа гибридизации.

Метод детекции Fox использует фотополимеризацию для создания крупных полимерных пятен, в которых происходит гибридизация; при этом для определения подтипов вируса гриппа используются дифференциальные паттерны гибридизации. Основным преимуществом данной методики перед существующими методами, такими как стандартная флуоресцентная детекция, является ее относительная дешевизна и возможность быстрого получения результата, видимого невооруженным глазом, при аналитической чувствительности, сопоставимой с флуоресценцией. Данный метод позволяет детально охарактеризовать вирусы гриппа с помощью «гриппового чипа», поскольку он является универсальным методом детекции.

Метод Ampl Fox также может быть применен к широкому спектру других систем, таких как другие микрочипы низкой плотности на основе ДНК и белков. Теоретически любой биотинилированный продукт может быть обнаружен с помощью amox. Процедуру продемонстрируют Эмбер Тейлор, младший научный сотрудник, и Кевин Моултон, лаборант-исследователь из компании Endeavor, которые в течение последних нескольких лет играли ключевую роль в разработке прибора Fox и химии детекции.

Выделите вирусную РНК из 200 µL вирусного изолята, используя набор для экстракции вирусной РНК и протокол производителя. Элюируйте 60 µL конечного объема и храните экстракты при температуре -70 °C или ниже для последующего использования. Затем приготовьте мастер-микс для RT-PCR на льду в соответствии с протоколом производителя.

Используя смесь БИОТИНИЛИРОВАННЫХ dNTP, добавьте к мастер-миксу смесь праймеров для чипа flu в концентрациях, указанных в таблице. Один праймер из каждого набора должен содержать 5'-фосфатную группу для облегчения ферментативного расщепления. Набор праймеров flu A дает продукт длиной 1032 п.н., а набор праймеров flu B — продукт длиной 811 п.н.

Кратковременно перемешайте на вортексе и распределите по 18 µL мастер-микса по ПЦР-пробиркам с тонкими стенками. Затем добавьте по 2 µL РНК-матрицы в каждую пробирку с реакционной смесью. Перенесите ПЦР-пробирки в амплификатор и используйте профиль циклирования с подходящей температурой отжига.

Здесь представлен профиль циклирования, используемый в данном анализе. Приготовьте смесь для ферментативного переваривания, объединив 2,2 µL буфера для ферментативной реакции, 0,8 µL воды, свободной от нуклеаз, и 1,0 µL фермента лямбда-экзонуклеазы на одну ПЦР-реакцию. Извлеките образцы из термоциклера и добавьте по четыре µL смеси в каждую ПЦР-пробирку.

Поместите образцы обратно в амплификатор и установите программу термоциклирования: 37 °C в течение 15 минут, затем 95 °C в течение 10 минут. Далее вокруг микрочипов, подлежащих гибридизации, установите одноразовые лунки для гибридизации. Затем промойте предметные стекла в 110 мл очищенной воды на орбитальном шейкере в течение пяти минут.

Высушите предметные стекла, аккуратно коснувшись салфетки края лунки. Смешайте 22 µL двухкратного буфера для гибридизации с каждым из продуктов фрагментированной одноцепочечной ДНК, кратко перемешайте и внесите по 40 µL в лунки микрочипа. Оставьте стекла для гибридизации на один час в камере влажности; по завершении гибридизации извлеките стекла из камеры и кратко промойте каждое стекло 2 мл промывочного буфера D. Поместите стекла в штатив.

Затем добавьте по 110 миллилитров промывочных буферов A и B в отдельные контейнеры, используя орбитальный шейкер. Промойте кассету со стеклами в буфере A при скорости 60–90 об/мин (эта скорость будет использоваться для всех последующих промывок) в течение одной минуты. Затем извлеките кассету из промывочного буфера A и коротко сполосните её промывочным буфером D. Перенесите кассету в промывочный буфер B и промывайте на орбитальном шейкере в течение пяти минут.

После промывки осторожно просушите массивы на каждом предметном стекле бумажной салфеткой и поместите высушенные стекла в камеру влажности. Для подготовки к этапам колориметрического детектирования по методу Фокса смешайте 10 µL амплитуды, 20 µL двухкратного буфера амплитуды и 10 µL очищенной воды для каждого обрабатываемого массива; перенесите 40 µL смеси меток на каждый массив и дайте реакции мечения протекать в закрытой камере влажности в течение пяти минут. Во время гибридизации подготовьте 110 mL промывочного буфера C в контейнере. После мечения немедленно промойте каждый массив промывочным буфером D. Поместите каждое предметное стекло в штатив для стекол и промывайте буфером C на орбитальном шейкере в течение пяти минут; после промывки буфером C трижды кратковременно погрузите штатив со стеклами в контейнер с очищенной водой.

Для удаления остатков соли высушите массивы, как было показано ранее. Храните массивы в темном кассете-боксе до момента фотоактивации и получения изображений, что должно быть выполнено в течение 24 часов. Затем включите ридер Amli Fox и убедитесь, что программное обеспечение Amli view готово к фотоактивации перед детектированием образцов массива.

Сначала определите оптимальное время фотоактивации для всех образцов, выполнив короткую процедуру калибровки. Перед ежедневным использованием прогрейте раствор Amplify до комнатной температуры и кратковременно перемешайте на вортексе, затем внесите три µL усилителя Amplify (amplify enhancer) в флакон с раствором Amplify и тщательно перемешайте на вортексе. В течение 10 секунд равномерно нанесите 40 µL раствора Amplify только на одно предметное стекло за раз, следя за тем, чтобы не было пузырьков воздуха.

Поместите предметное стекло с микрочипом в отсек для фотоактивации прибора Amplify Reader. Запустите фотоактивацию, выбрав команду start в программном обеспечении PL view, используя время фотоактивации, определенное в процессе калибровки. По завершении промойте микрочип двумя миллилитрами очищенной воды для удаления излишков полимера amplify clear; теперь на пятнах, содержащих целевую ДНК, образовался полимер, который стал лучше визуализироваться.

После окрашивания дайте полимерным пятнам высохнуть в течение двух минут. Затем нанесите две капли amply red на массив и оставьте для окрашивания на две минуты. После окрашивания быстро промойте предметное стекло очищенной водой и высушите, как показано ранее; поместите предметное стекло в отсек для визуализации ридера Amli Fox для получения изображения с использованием программного обеспечения amli для обработки результатов. На левом изображении показано обнаружение образца нового штамма H1N1 2009 года с помощью Amli Fox.

В то время как на изображении справа используется традиционная флуоресценция, полученная с помощью конфокального сканера флуоресцентных микромассивов, общая картина детекции легко прослеживается для обоих методов. Однако результат Amli fox виден невооруженным глазом. На этих изображениях представлены результаты анализа флуоресцентных чипов для образцов человеческого происхождения H3N2, человеческого происхождения H1N1, свиного происхождения H1N1, а также отрицательный массив fox, в котором не обнаружено гриппа.

Последовательности A два и три, выделенные синим цветом, дают сигнал для всех показанных подтипов гриппа, однако последовательности, выделенные красным цветом в правом нижнем углу, дают сигнал только для образца H1N1 свиного происхождения. Отрицательный образец демонстрирует сигнал по последовательности внутреннего контроля, выделенной зеленым цветом, что указывает на отсутствие ингибирования или сбоя в реакции RT-PCR.

После освоения всего процесса — от извлечения из флакона до детектирования amox и интерпретации окончательного результата — процедура может быть выполнена примерно за шесть часов. Этап детектирования Ampl Fox, включая калибровку прибора, может быть завершен примерно за 30 минут после выполнения данной процедуры. Для получения дополнительных ответов могут быть применены другие методы, такие как частичное или полногеномное секвенирование.

Данный анализ на грипп предназначен для первичного скрининга, особенно для образцов, которые дают уникальный паттерн гибридизации. Поскольку этот метод детекции является универсальным анализом, мы надеемся, что исследователи найдут новые интересные способы применения микромассивов низкой плотности, в которых такая детекция принесет дополнительную пользу.