Микрофлюидных Изготовление Чип и метод для выявления гриппа

Общая цель данного эксперимента заключается в обнаружении вируса гриппа А с помощью микрофлюидного чипа. Сначала пропустите образец с буфером для лизиса через канал SPE, чтобы лизировать вирус и извлечь РНК, загрузите реагент R-T-P-C-R с экстрагированной РНК и запустите канал обратной транскрипции для преобразования вирусной РНК в CDNA. Далее запустите смесь в канал ПЦР для того, чтобы амплификировать получаются результаты ДНК, показывающие размер и концентрацию ампликона на основе сигнала флуоресценции от капиллярного электрофореза.

Основное преимущество этой технологии заключается в том, что она принимает сырой образец пациента и объединяет экстракцию нуклеиновых кислот, очистку, обратную транскрипцию и амплификацию в одном чипе Чтобы создать две бляшки, равномерно распределите примерно девять граммов гранул XN X в центре металлической пластины, поместите на пресс, нагретый при температуре 198 градусов Цельсия, на пять минут. Затем медленно прижмите до 2 500 фунтов на квадратный дюйм еще пять минут. Теперь поместите одну табличку на эпоксидную форму, нагрейте до 157 градусов Цельсия в течение 10 минут и медленно надавите на 1000 фунтов на квадратный дюйм в течение еще 10 минут.

Далее, надев термоперчатки, удалите налет и плесень из горячего пресса, а затем снимите налет с формы до того, как она остынет. Просверлите три отверстия в тисненой стружке, по одному на входе, сливном отверстии и выходе микрофлюидного канала. Затем промойте чипсы IPA, а затем удалите РНК и воду дианны.

Высушите чипсы на воздухе, чтобы склеить чипсы сначала разогрейте при 131 градусе Цельсия в течение 10 минут, а затем нажмите при 350 фунтах на квадратный дюйм еще 10 минут. Используя JB Weld Epoxy, прикрепите нанопорты на входе и выходе отдельно для отверждения в течение 15–24 часов. В соответствии с инструкциями производителя, промойте канал SPE 50 микролитрами РНК, а затем 100 микролитрами воды, не содержащей нуклеаз.

Теперь загрузите канал SPE четырьмя микролитрами свежеприготовленного раствора для прививки, чтобы сшить метакрилат, инкубировать в течение 10 минут в ультрафиолетовой печи, удалить остаточный раствор для прививки с помощью вакуума. Разбейте высохшую микросферную гранулу, постукивая по трубке с закрытой крышкой. Затем добавить 100 микролитров свежеприготовленного раствора SPE для колонки и вортекс перемешать.

Загрузите четыре микролитра раствора SPE в тот же канал с помощью УФ-облучения в течение 2,5 минут с каждой стороны, в результате чего получится непрозрачная белая полимеризованная колонка SPE. Промойте канал 500 микролитрами 100% метанола, чтобы смыть излишки реагентов и внутриполимерных пирогенных растворителей. Прикрепите два тонкопленочных нагревателя к нижней части чипа с помощью теплопроводящей ленты.

Обратите внимание, что боковые стороны нагревателей должны быть выровнены по краю широких каналов для длительности Дене и на коленях отдельно, поместить пять термопар в чип через тупиковые открытые боковые каналы каждой ленты чипа. Чтобы зафиксировать расположение термопар, добавьте четыре микролитра 25 XRNA secure до 96 микролитров 70% этанола в одну пробирку, и до 100% этанола во вторую пробирку. Также приготовьте 300 микролитров канального буфера и 316 микролитров лизисного буфера.

Нагрейте растворы до 60 градусов Цельсия в течение 15 минут. Чтобы активировать РНК безопасно, затем уравновесить микрофлюидный канал. Пропустите буфер канала через канал SPE со скоростью потока 0,8 миллилитров в час.

Теперь быстро тестируемый образец в VTM при 37 градусах Цельсия. Извлеките образец, как только он разморозится. Центрифугируйте образец при 13 000 об/мин в течение 10 минут.

Переведите 100 микролитров надосадочной жидкости в 300 микролитров буфера для лизиса, и добавьте шесть микролитров по одному микрограмму на микролитр носителя, РНК вихря для смешивания. Затем вращайте в течение пяти секунд и загрузите весь лизат в приманочный замок одного шприца CC. Пропустите лизат через канал SPE со скоростью потока 0,8 миллилитра в час.

Затем промойте канал SPE 100 микролитрами 70% этанола, а затем 100 микролитрами 100% этанола со скоростью один миллилитр в час. Установите пустой шприц на отметку 0,5 миллилитра и протолкните воздух через канал, чтобы высушить его со скоростью один миллилитр в час. Теперь пропустите через канал 67,5 микролитров воды, свободной от нуклеаз, чтобы элюировать связанные нуклеиновые кислоты со скоростью 0,5 миллилитра в час, и соберите 13,5 микролитров из нанопорта в порту отходов.

Загрузите 36,5 микролитров мастера R-T-P-C-R. Смешайте в нанопорту в порту отходов и смешайте с матричной РНК для реакции R-T-P-C-R объемом 50 микролитров. Затем загрузите смесь R-T-P-C-R в канал RT с помощью слабого вакуума.

Закройте нанопорт закрытым фитингом. Подайте напряжение 35 вольт на обогреватель один. Держите реагенты в канале RT в течение 30 минут после нагревателя, один из которых уравновесится при 50 градусах Цельсия.

Держите реагенты в канале RT в течение 15 минут после того, как нагреватель уравновесится при 95 градусах Цельсия. Затем подайте 27 вольт на один нагреватель и 50 вольт на обогреватель, два на уравновешивающий обогреватель, один на 60 градусов Цельсия и два на нагреватель на 95 градусов Цельсия. Проталкивайте реагенты в канал ПЦР со скоростью 0,5 микролитра в минуту.

Примерно через 20 минут, когда реагенты приблизятся к концу серпентинового канала, соберите продукты ПЦР на выходе с помощью пипеттера соответствующего размера и наконечника для высокочувствительного теста ДНК Agilent. Извлеките набор высокочувствительных ДНК Agilent из холодильника за 30 минут до начала тестирования. Включите биоанализатор и откройте экспертное программное обеспечение 2, 100

Загрузите один микролитр ПЦР-продуктов для анализа и следуйте протоколу Agilent. Анализируйте и записывайте данные В этом рабочем процессе. Образец носоглотки пациента смешивают с буфером для лизиса и прикладывают к чипу.

Чип запускается, и продукты ПЦР вируса гриппа окрашиваются в красный цвет с помощью коммерческого чипа для капиллярного электрофореза. Из-за разного количества вируса гриппа в образце каждого пациента конечная концентрация продукта ПЦР будет варьироваться. Хороший результат должен иметь низкий уровень шума для устранения пиков лестницы на 35 и 10, 380 паре оснований и одиночный пик произведения при расчетном размере произведения 107 пары оснований для положительной выборки.

После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как изготовить и запустить микрожидкостный чип для обнаружения вируса гриппа А.