Эластомерные PGS Строительные леса в Артериальная тканевой инженерии

В этом видео демонстрируется способ изготовления пористых трубчатых скаффолдов и их последующего динамического механического кондиционирования для инженерии артериальной ткани. Сначала скаффолды изготавливаются из биоразлагаемого эластомера методом термического слияния. Затем скаффолды подготавливаются к посеву клеток и устанавливаются в систему биореактора.

В биореакторе гладкомышечные клетки сосудов засевают скаффолды, после чего их культивируют. Спустя несколько недель ткань собирают и анализируют с помощью сканирующей электронной микроскопии, окрашивания гематоксилином и эозином, а также анализа автофлуоресценции эластина. Полученная гладкая мышца характеризуется многослойностью и перпендикулярной ориентацией.

Основным преимуществом данного метода, аналогичного селективному вымыванию частиц, является использование стеклянной формы для изготовления пористого трубчатого каркаса из гиалуроновой кислоты. В качестве формы используется отрезок стеклянной трубки. Поместите трубку в держатель и залейте в нее раствор гиалуроновой кислоты, приготовленный накануне.

Гиалуроновая кислота медленно стекает по внутренней стенке. Когда она достигнет дна формы, переверните форму. Повторяйте этот шаг до тех пор, пока внутренняя стенка формы не будет равномерно покрыта раствором.

После нанесения покрытия высушите все подготовленные стеклянные формы в вакуумном шкафу при 37 °C в течение 24 часов. Обычно параллельно с сушкой стеклянных форм готовят еще четыре формы. Подготовьте порции частиц соли, измельчив частицы SVE соли до размера от 25 до 32 µm.

На следующий день соберите подготовленный стержень стеклянной формы, ПТФЭ-трубки, термоусадочный рукав и ПТФЭ-кольцо. Сначала вставьте стержень в отрезки ПТФЭ-трубки длиной 65 мм и выдержите их при температуре 120 °C в течение пяти минут. Для усадки ПТФЭ заранее прогрейте инкубатор для гибридизации при 37 °C не менее 30 минут.

После того как трубка обхватит мандрели, наденьте термоусадочную трубку на мандрель так, чтобы она свободно перемещалась. Затем поместите мандрель в стеклянную форму и прикрепите кольцо из ПТФЭ к нижней части мандреля. Убедитесь, что кольцо из ПТФЭ плотно прилегает к дну стеклянной формы.

Затем с помощью шпателя и воронки из силиконового каучука поместите суспензии частиц соли в стеклянную форму. После этого осторожно постучите по форме шпателем для равномерного распределения частиц и снимите излишки соли. Теперь выключите прогретый инкубатор и быстро поместите в него формы с плотно упакованной солью; в течение следующих 30 минут соль спечется, после чего формы следует сушить в вакуумном шкафу при 37 °C в течение 24 часов.

На следующий день после охлаждения извлеките стержень из нержавеющей стали из форм, выталкивая его и удерживая кольцо из ПТФЭ. При необходимости используйте острогубцы. Затем снимите кольцо из ПТФЭ с нижней части формы.

Затем запекайте формы для усадки гильз, после чего извлеките усаженные гильзы из форм. Дайте формам остыть до момента их использования и храните их в эксикаторе в вытяжном шкафу. С помощью дозатора, удерживая стеклянные формы под углом 45 градусов, закапывайте раствор PGS во внутренний просвет, медленно вращая форму.

Проверьте, стекает ли раствор PGS по стенке формы. Если образовалось сухое пятно, добавьте больше PGS. Теперь дайте THF испариться в вытяжном шкафу в течение не менее 30 минут. После полного испарения THF подвергните формы отверждению в вакуумном шкафу.

После отверждения в течение одного дня охладите формы до комнатной температуры и медленно, в вертикальном направлении, погрузите их в деионизированную воду при температуре 24 °C. Слишком быстрое погружение приводит к образованию пузырьков воздуха, которые разрывают каркас. Осторожно перенесите формы в водяную баню.

Расположите их под углом, используя силиконовую трубку, и дайте гиалуроновой кислоте раствориться в течение часа. Если через час гиалуроновая кислота не вышла из формы, то, не вынимая форму из жидкости, осторожно выдавите гиалуроновую кислоту шпателем с обоих концов, а затем медленно встряхните форму. После этого убедитесь, что скаффолды не сместились внутри стеклянной формы; если это произошло, медленно вытяните скаффолд пинцетом, чтобы извлечь его из формы.

Затем вымойте частицы соли, осторожно перенеся хрупкие каркасы в ванну с деионизированной водой при медленном перемешивании. Этот процесс займет не менее трех дней; при этом воду необходимо менять ежедневно. После полного вымывания соли перенесите каждый каркас в центрифужную пробирку объемом 15 миллилитра, наполненную деионизированной водой, и заморозьте их в контейнере с сухим льдом в течение одного часа. Поместите замороженные центрифужные пробирки с открытыми крышками в лиофилизатор на три дня.

После лиофилизации храните скаффолды в эксикаторе до момента использования. Начните с того, что разрежьте скаффолды на отрезки длиной от 25 до 30 миллиметров. Затем подготовьте две силиконовые резиновые пробки, продев трубку из ПТФЭ через центральные отверстия каждой пробки.

Затем отрежьте сегменты термоусадочного кольца длиной 1,5 мм и наденьте один из них на один конец каркаса. Вставьте одну трубку из ПТФЭ, прикрепленную к пробке, в тот же конец каркаса с небольшим перекрытием, чтобы она оказалась под термоусадочным кольцом для надежного соединения каркаса с трубкой; усадите кольцо в печи и дайте всей сборке остыть до комнатной температуры. После этого поликарбонатную трубку длиной 50 мм, которая служит камерой биореактора, надевают на каркас и фиксируют у внутренней поверхности силиконовой резиновой пробки.

Как и прежде, с другого конца каркаса с помощью кольца hs фиксируются еще одна трубка из PTFE и пробка для завершения формирования камеры. Вторая пробка прикрепляется к другому концу поликарбонатной трубки. Затем внешние поверхности пробок фиксируются на двух пластинах из алюминиевого сплава.

Вставьте по две резьбовые шпильки в боковое отверстие каждой пластины и зафиксируйте пластины винтами с накаткой. Прикрепите скаффолд к биореактору. Теперь измерьте видимую длину каждого скаффолда, которая представляет собой расстояние между двумя кольцами hs, и рассчитайте площадь их внутренней поверхности.

Для посева клеток. В автоклаве стерилизуют камеры, каждую из которых предварительно индивидуально обернули в фольгу, а также каждую часть блока биореактора. После стерилизации биореактор собирают внутри ламинарного шкафа для культивирования клеток.

Проведите предварительную обработку и промывку скаффолда путем серии перфузий с использованием перистальтического насоса со скоростью потока 1 мм/мин в контуре. Начните с промывки 70% этанолом, 50% этанолом, а затем 25% этанолом по одному часу для каждого раствора. После трех этапов промывки этанолом проведите двухчасовую промывку в PBS.

Наконец, промойте биореактор культуральной средой для гладкомышечных клеток (SMC) в течение 24 часов, после чего он будет готов к посеву клеток и проведению экспериментов. Теперь, следуя инструкциям в сопроводительной рукописи, засейте биореактор клетками из расчета 2 миллиона клеток на сантиметр квадратный и в течение следующих 21 дня заменяйте среду в трубках и корректируйте скорость работы насоса. Постепенно давление в конструкции будет увеличиваться примерно от 4 мм рт ст в первый день культивирования до более чем 100 мм рт ст через две недели культивирования; после трех недель культивирования соберите клетки и подготовьте их к анализу, как указано в сопроводительной рукописи.

Данные трубчатые каркасы из PGS были изготовлены методом слияния солей. Снимки сканирующего электронного микроскопа продемонстрировали, что все каркасы имели однородную толщину стенок и не имели частичных дефектов в поперечных сечениях. На просветной поверхности всех каркасов наблюдались случайно распределенные макро- и микропоры.

После культивирования гладкомышечные клетки (ГМК) многослойного типа росли перпендикулярно направлению потока. Кроме того, клетки и белки внеклеточного матрикса (ВКМ) полностью покрыли просвет всех конструктов из PGS. Автофлуоресценция эластина также выявила циркулярно организованные эластические волокна на поверхности просвета конструкта.

После просмотра этого видео вы должны понять, как изготовить пористый трубчатый скаффолд, визуализировать клетки и культивировать скаффолд с использованием специально разработанного биореактора.