Инжиниринг двухслойных гидрогель для управления ASC дифференциации

Общая цель данной процедуры заключается в создании композитного матрикса из природных биоматериалов, который может быть использован для доставки и дифференцировки стволовых клеток для ускорения заживления ран. Это достигается путем первоначального выделения стволовых клеток, полученных из жировой ткани, или A SC из подопытного животного. Затем A SC загружаются в предварительно изготовленные хитозановые микросферы.

Затем отливают гель из ФИБРИЛЛИРОВАННОГО коллагена, и поверх коллагенового геля наносят слой бусин A-S-C-C-S-M. В завершение поверх коллагенового геля A-S-C-C-S-M отливают ПЭГ-фибриновый гель и добавляют среду. В итоге можно получить результаты, демонстрирующие двунаправленную одновременную миграцию A SC из бусины CSM в коллагеновый и ПЭГ-фибриновый матриксы.

Благодаря данной процедуре один и тот же источник стволовых клеток может получать различные сигналы дифференцировки от микроокружений из коллагена и ПЭГ-фибрина, что приводит к их дифференциальной стимуляции для выработки плеотропных факторов и формирования сети преваскулярных структур. Главное преимущество этого метода перед существующими подходами, такими как композиты из одного материала или децеллюляризированные заменители кожи, заключается в том, что другие продукты не обеспечивают активную реваскуляризацию продукта организмом реципиента. Идея этого метода возникла у нас, когда мы заметили, что изолированные RAD A SE склонны дифференцироваться в сосудистый фенотип при культивировании в матриксе из свиного фибрина.

Это наблюдение привело к идее о том, что единый источник стволовых клеток может быть использован одновременно в системе, состоящей из различных биоматериалов. После выделения и культивирования стволовых клеток, полученных из жировой ткани (ASCs), приготовления микросфер из хитозана (CSMs) и загрузки ASCs в CSMs, приготовьте гидрогель из полиэтиленгликоля и фибрина, растворив модифицированный сукцинилглутаратом PEG в 4 mL трис-буферного физиологического раствора. Непосредственно перед началом эксперимента простерилизуйте раствор, используя фильтр с порами 0.22 µm.

В лунку шестилуночного планшета смешайте 500 µL стокового раствора фибриногена и 250 µL стокового раствора ПЭГ, затем инкубируйте в течение 20 минут в увлажненном инкубаторе при 37 °C в атмосфере 5% CO₂. Далее смешайте 250 µL предварительно приготовленного A-S-C-C-S-M с раствором пегилированного фибриногена, немедленно добавьте 1 mL стокового раствора тромбина и с помощью пипетки быстро перемешайте один или два раза. Сразу после этого перенесите смесь клеток и геля в 12-луночный планшет и инкубируйте в увлажненной камере при 37 °C в атмосфере 5% CO₂ в течение 10 минут. Затем дважды промойте полученный ПЭГ-фибрин раствором HBSS и инкубируйте в минимальной эссенциальной среде alpha с добавлением 10% FBS в увлажненном инкубаторе при 37 °C в атмосфере 5% CO₂, используя стандартные методы световой микроскопии на протяжении 11 дней.

Наблюдайте за миграцией клеток из CSM в гелевую смесь, A-S-C-C-S-M с коллагеном первого типа, экстрагированным из сухожилий крысиного хвоста с использованием двухнормального раствора гидроксида натрия. Доведите pH до 6.8 и проведите фибрилляцию. Добавьте фибриллированный коллаген и смесь A-S-C-C-S-M в 12-луночный планшет и инкубируйте в увлажненном инкубаторе при 5% carbon dioxide и 37 градусов Celsius в течение 30 минут.

После проверки завершения фибрилляции инкубируйте гели коллагена A-S-C-C-S-M в течение периода до 11 дней в увлажненном инкубаторе с 5% углекислого газа при 37 °C. Наблюдайте за миграцией клеток из CSM в гель на протяжении 11 дней, используя стандартные методы микроскопии, для формирования двухслойной конструкции с целью изучения миграционных свойств и свойств коиндукции единого источника стволовых клеток с использованием двух биокаркасов.

Приготовьте коллагеновые гели и гели из ПЭГ-фибрина с following небольшими модификациями: приготовьте 1 мл коллагена в концентрации 7,5 mg/mL. Затем перенесите смесь в шестилуночный вкладыш для культуральных тканей и инкубируйте в течение 30 минут при 37 °C. После полного образования фибрилл нанесите на поверхность коллагена 200 µL ASC-CM в культуральной среде.

После того как микросферы осядут на гель, приготовьте ПЭГ-фибриновый гель, используя 250 µL среды для культивирования клеток. Затем нанесите слой раствора пегилированного фибриногена и тромбина поверх коллагеновых слоев A-S-C-C-S-M. По завершении инкубируйте конструкты в течение 30 минут в увлажненном инкубаторе с 5% carbon dioxide для полного завершения процесса.

Наконец, поместите 1 мл среды в верхнюю камеру над конструктом и 3 мл среды в нижнюю камеру. Характеристика SC, встроенной в данный скаффолд, показала, что SC, нагруженные CSM, могут находиться между слоем коллагена и ПЭГ-фибрина, одновременно и дифференцированно получая сигналы из обеих внеклеточных сред для выживания в новых условиях. Как показано здесь, коллаген поддерживал способность ASC оставаться стволовыми клетками, что подтверждалось экспрессией stro-1 (зеленый цвет), а также их фибробластоподобной морфологией.

Напротив, ПЭГ-фибрин индуцировал дифференцировку ASC в сторону аваскулярного фенотипа, что подтверждается их трубчатой морфологией, представленной здесь, с наличием просвета и специфичной для эндотелиальных клеток экспрессией фактора фон Виллебранда, показанной здесь красным цветом. Кроме того, как продемонстрировано здесь, наблюдаемые фенотипы, по всей видимости, проявлялись на ранних этапах культивирования и сохранялись в течение 11 дней. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как выделять стволовые клетки из жировой ткани крысы, загружать их в хитозановые микросферы и включать их в состав двухслойного гидрогеля с использованием биоматериалов, одобренных FDA.

Не забывайте, что биоматериалы и клетки, используемые в данном протоколе, получены от животных и людей и могут быть крайне опасны, если они загрязнены патогенами организма-хозяина. При выполнении этих процедур всегда следует соблюдать меры предосторожности, такие как использование средств индивидуальной защиты и применение методов асептического культивирования клеток.