Твердые пластины основе Диетические ограничения в Caenorhabditis Элеганс

В данной процедуре проводится ограничение рациона на стандартной чашке с питательной средой для изучения его влияния на долголетие, репродукцию и метаболизм. Это достигается путем предварительного точного измерения концентрации бактерий, которые будут использоваться в качестве источника пищи. Вторым этапом процедуры является надлежащее разведение бактериальной культуры до необходимых концентраций.

Затем приготовьте базовые чашки SDR с убитыми бактериями. В завершение проведите эксперименты SDR с популяцией червей с синхронизированным возрастом. Результаты измерения продукции потомства и продолжительности жизни могут продемонстрировать задержку и снижение продукции потомства, а также увеличение средней продолжительности жизни.

Основным преимуществом данного метода по сравнению с методами, подобными методу Диана в среде AZA, является то, что весь эксперимент проводится на стандартных чашках с твердой средой на основе AGA, которые используются в большинстве лабораторий. Для экспериментов по ограничению рациона питания постройте отдельные калибровочные кривые для каждого штамма бактерий, используемого в качестве источника пищи. Возьмите одну колонию бактерий e coli OP 50 из свежего посева на LB-агаре и инокулируйте три миллилитра жидкой среды LB-бульона, культивируя в шейкере при 37 °C в течение ночи. Подготовьте серию двукратных разведений ночной культуры.

Затем измерьте абсорбцию каждого разведения при 600 нанометрах с помощью спектрофотометра в трех повторностях. Далее разведите каждую бактериальную суспензию в миллион раз, равномерно нанесите по 0,4 миллилитра бактериальной суспензии каждого разведения на чашку с LB-агаром диаметром 100 миллиметров и инкубируйте при 37 градусах Цельсия от 18 до 24 часов. Подсчитайте количество выросших на каждой чашке бактериальных колоний, чтобы рассчитать количество колониеобразующих единиц на миллилитр для каждого образца.

Теперь постройте график зависимости OD 600 от концентрации бактерий и проведите линейный регрессионный анализ, чтобы установить взаимосвязь между измеренными значениями OD 600 и концентрацией бактерий OP 50. Для данного метода при кормлении ad libitum используется концентрация бактерий 1 × 10¹¹ КОЕ/мл, а для оптимального режима кормления DR — 1 × 10⁸ КОЕ/мл. Однако для установления полной дозозависимой взаимосвязи может потребоваться использование от четырех до шести различных концентраций бактерий.

Для SDR и анализа ответов. Подготовьте инокулят из одной колонии бактерий e coli OP 50 в трех миллилитрах жидкой среды LB, культивируя их в шейкере при 37 °C в течение шести-восьми часов. Перенесите культуру OP 50 в новую колбу, содержащую 500 миллилитров среды LB, и выращивайте в течение ночи до достижения бактериями состояния насыщения, если это необходимо.

Подготовьте соответствующий разведение культуры OP 50 для измерения оптической плотности при OD 600. Для определения концентрации бактерий осадите их центрифугированием при 1500 Gs в течение 20 минут. Удалите супернатант и ресуспендируйте бактерии до концентрации 1 × 10¹² КОЕ на миллилитр.

Теперь подготовьте бактериальные культуры объемом 10 мл в шести различных концентрациях: от 1 × 10¹² до 1 × 10⁷ КОЕ/мл. Перенесите с помощью пипетки 0,2 мл бактериальной культуры в центр чашки с застывшим N GM агаром диаметром 60 мм. Старайтесь не касаться поверхности агара кончиком пипетки, так как зазубрины на поверхности позволяют червям зарываться в агаризат.

Поместите планшеты в инкубатор при температуре 37 °C на один час. Затем нанесите на каждый планшет 10 µL carbonic soin в концентрации 100 mg/mL и 10 µL can mycin в концентрации 50 mg/mL, чтобы остановить рост бактерий. Храните планшеты с различными концентрациями антибиотиков, подавляющих рост бактерий, при температуре 4 °C для дальнейшего использования в течение одного месяца.

Важно подготовить и сохранить достаточное количество чашек, желательно из одной партии для всего растения. Проведите эксперимент за один-два дня до начала основных работ, чтобы проверить жизнеспособность бактерий. Соскребите часть бактерий с чашек SDR и распределите их по пустой чашке N GM с карбоником, сейном и антимицином.

Поместите планшет в инкубатор при температуре 37 °C на шесть-восемь часов и убедитесь в отсутствии бактериального роста. Для большинства исследований, связанных с SDR, таких как анализ продолжительности жизни и профилирование продукции потомства, необходима подготовка возрастно-синхронизированной популяции червей. Используя платиновую петлю для червей, перенесите 20–30 репродуктивно активных взрослых особей на несколько обычных чашек с NGM.

С использованием OP 50. В зависимости от количества яиц, необходимых для экспериментов, может потребоваться большее число взрослых особей. Оставьте чашки при температуре 20 °C на четыре часа для откладки яиц.

Удалите взрослых особей с чашки и визуально проверьте чашки на наличие яиц. Продолжите инкубацию чашек при 20 °C, чтобы потомство достигло поздней стадии L4 или первого дня взрослой стадии. Обычно для червей дикого типа N2 при 20 °C это занимает три дня.

Для анализа продолжительности жизни. Перенесите 10–12 взрослых червей одного дня развития на планшет с SDR для инициации диетического ограничения. Для обеспечения достаточной статистической значимости используйте в общей сложности от 60 до 100 червей для каждого условия SDR.

Оценивайте жизнеспособность каждого червя каждые два-три дня до тех пор, пока все черви не погибнут. Важно переносить червей на свежие чашки с SDR через день, чтобы избежать голодания. На данном калибровочном графике представлена зависимость концентрации OP 50 от значения OD 600.

Уравнение, полученное в результате линейного регрессионного анализа, может быть использовано для всех последующих расчетов концентрации бактерий OP 50. В данном исследовании оценивается влияние хронического ограничения рациона (SDR) на среднюю продолжительность жизни различных штаммов червей по сравнению с нормальной дозозависимой реакцией червей дикого типа на SDR. Эффект SDR на продолжительность жизни частично подавляется сверхэкспрессией DR 2, в то время как мутация DAF 16 MU 86 не влияет на индуцированное SDR увеличение продолжительности жизни.

После просмотра этого видео вы должны будете четко понимать, как выполнять прием Dian в стандартной игре на основе AGA в стиле sea elegance.