Трансмембранного домена олигомеризации склонность определяется Пробирной ToxR

Общая цель следующего эксперимента — исследовать склонность белков, трансмембранных доменов или TMD к лигаментизации в естественной мембранной среде. Это достигается путем экспрессии интересующего трансмембранного домена в e coli в виде химерного белка с мальтозосвязывающим белком для локализации в периплазме и tox R в качестве транскрипционного репортера; индуцированная лигаментизация трансмембранного домена приводит к димеризации tox R и активации транскрипции LXi. На втором этапе клетки подвергают лизису и обрабатывают ONPG, который гидролизуется бета-галактозидазой с образованием поглощающего свет соединения — о-нитрофенолята или ONP.

Затем уровни ONP количественно определяют путем измерения поглощения света при 405 нанометрах. Для определения уровней трансмембранного домена результаты лигантезации позволяют выявить склонность трансмембранных доменов к лигантезации на основе репортерного анализа tox R. Основное преимущество данного метода перед существующими биофизическими методами, такими как SDS-PAGE или флуоресценция, заключается в том, что поведение трансмембранного домена изучается в естественном фосфолипидном бислое посредством экспрессии в e coli, а не в системе-имитаторе мембраны, такой как детергент.

Данный метод может помочь в решении ключевых вопросов в области мембранных белков, таких как выяснение основных структурных особенностей, участвующих в ассоциации трансмембранных спиралей. Перед началом данного протокола подготавливают семь плазмид, экспрессирующих необходимый химерный белок, из коммерчески синтезированных олигонуклеотидов, представляющих интересующую последовательность TDS, фланкированную сайтами NHE1 и BamHI. После подготовки плазмид с сайтами рестрикции осторожно размораживают компетентные клетки fhk 12 на льду. После размораживания клетки переносят в культуральные пробирки объемом 15 мл, добавляют по 200 нг каждой плазмидной ДНК в отдельную пробирку и инкубируют клетки на льду в течение 30 минут.

Затем подвергните клетки тепловому шоку в течение 90 секунд при 42 °C, после чего инкубируйте их на льду в течение двух минут в 800 µL среды SOC; далее инкубируйте образцы при 37 °C с перемешиванием в течение одного часа. После инкубации инокулируйте 5 мл среды LB, содержащей хлорамфеникол и анозу, 50 µL смеси для трансформации, используя 15-мл культуральные пробирки в трех повторностях для каждого образца. В завершение инкубируйте образцы при 37 °C с перемешиванием в течение 20 часов. Для измерения общей лигандизации определяют активность TDS бета-галактозидазы.

Сначала предварительно нагрейте планшетный ридер до 28 °C. Используя исходный Z-буфер, приготовьте свежие растворы Z-буфера согласно описанному в письменном протоколе. Перенесите Z-буфер с хлороформом из пробирки в резервуар, стараясь набирать пипеткой только верхний водный слой Z-буфера с хлороформом.

Поместите 96-луночный планшет на лист бумаги с начерченной сеткой, чтобы обеспечить точность пипетирования. Перенесите 100 µL хлороформного Z-буфера в каждую лунку 96-луночного планшета, затем добавьте по 5 µL каждой культуры в четырех повторностях. В четырех лунках, которые будут служить холостыми пробами, культуру не добавляйте. Измерьте OD 595 планшета для определения плотности клеток.

Добавьте 50 µL буфера Z-SDS в все лунки планшета. Затем встряхивайте планшет в планшетном ридере в течение 10 минут для лизиса клеток. После лизиса клеток добавьте 50 µL ZPA для ONPG во все лунки. Верните планшет в планшетный ридер и измеряйте OD 405 каждые 30 секунд в течение 20 минут.

Определите уровень активности бета-лактамазы путем расчета единиц Миллера с нормализацией по холостой пробе. Для подтверждения эквивалентной экспрессии белка между конструктами проводится вестерн-блоттинг. Сначала объедините по 50 µL культур из трех повторностей, затем центрифугируйте образцы в микроцентрифуге.

Удалите супернатант с помощью пипетки и ресуспендируйте осадок. Растворите оставшийся осадок в 2х буфере для нанесения образцов. Нанесите по 7,5 µL каждого образца на стандартный 8% гель и проведите электрофорез при 125 В в течение одного часа и пяти минут. После переноса инкубируйте мембрану с антителом, конъюгированным с M-V-P-H-R-P, для визуализации химерного белка; белок наблюдается при массе примерно 70 kDa, при этом иногда видны продукты деградации в районе 48 kDa.

Эндогенный MVP также наблюдается при 45 килодальтонах. Чтобы оценить правильность встраивания в мембрану химерного конструкта TMD, используется клеточная линия PD 28 с дефицитом мальтозосвязывающего белка; при выращивании в минимальной среде с мальтозой в качестве единственного источника углерода могут расти только те клетки, которые экспрессируют интегральный мембранный продукт с мальтозосвязывающим белком, правильно локализованным в периплазме. Трансформируйте клетки PD 28, как описано для клеток fhk 12, и инокулируйте в два миллилитра среды LB.

После инкубации культивируйте клетки при 37 °C с перемешиванием при 300 RPM в течение ночи. Осадите клетки путем центрифугирования, затем промойте, ресуспендировав их в двух миллилитрах PBS и осторожно перемешивая с помощью наконечника большого объема. После осаждения повторно промойте клетки PBS, затем проведите финальное центрифугирование и ресуспендируйте в одном миллилитре PBS.

Используйте 25 µL ресуспендированных клеток для инокуляции пяти миллилитров минимальной среды. Инкубируйте клетки при 37 °C с перемешиванием в течение 15 часов. Перенесите по 200 µL каждой пробы в планшет на 96 лунок и измерьте оптическую плотность при 595 нм с помощью планшетного ридера.

Повторяйте этот процесс каждые два часа в течение 25 часов. Склонность к олигомеризации каждого отдельного трансмембранного домена мультипасс-интегрального мембранного белка — латентного мембранного белка 1 — была проанализирована с помощью репортерного анализа транскрипции tox R. Трансмембранный домен пять демонстрирует сильную склонность к олигомеризации, что подтверждается высокими значениями единиц Миллера, сопоставимыми с положительным контролем — общеизвестной димеризующейся последовательностью GPAA.

Вредная мутация в пятом трансмембранном домене D1 50 A снижает способность последовательности аллигировать LMP1; TM1 не аллигирует существенно и демонстрирует очень низкий сигнал в единицах Миллера, лишь немного превышающий сигнал холостого контроля (нетрансформированных клеток FHK 12). После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как определить, способен ли интересующий вас трансмембранный спиральный сегмент формировать комплексы высшего порядка в естественной мембранной среде. При выполнении данной процедуры крайне важно очень осторожно дозировать реагенты в 96-луночный планшет, чтобы избежать значительных погрешностей и исключить появление пузырьков воздуха.