Высокопроизводительный скрининг и биодатчиков с люминесцентными С. Элеганс Штаммы

В данном видео демонстрируется метод культивирования и дозирования флуоресцентных штаммов C. elegans для высокопроизводительного скрининга химических библиотек или обнаружения загрязнителей окружающей среды с целью оценки влияния химических или экологических факторов на активность конкретных белков. При работе с C. elegans сначала готовятся бактериальные культуры в качестве корма для червей, затем культивируются синхронизированные трансгенные черви, экспрессирующие GFP.

Затем собирают, промывают и распределяют от 0,5 до 2 миллионов червей по трем 84-луночным микротитрационным планшетам, после чего к червям добавляют малые молекулы из химической библиотеки или тестовые образцы, такие как вода, пища или почва. В завершение измеряют флуоресценцию червей с помощью планшетного ридера.

Анализ данных по интенсивности флуоресценции позволяет выявить малые молекулы, которые модулируют индуцибельные транскрипционные пути или позволяют обнаруживать загрязнители окружающей среды. Основным преимуществом данного метода перед существующими подходами, такими как анализы in vitro и на культурах клеток, является то, что время не будет затрачено на соединения, которые токсичны или неактивны in vivo. Этот высокопроизводительный метод может помочь в идентификации малых молекул, модулирующих различные индуцибельные пути.

Хотя мы разработали этот метод для высокопроизводительного скрининга библиотек малых молекул, он также может быть применен для биосенсинга загрязняющих веществ в пищевых и экологических образцах. Процедуру продемонстрируют Эндрю Дайн, техник моей лаборатории, и Кью Лонг, постдок моей лаборатории. Заранее подготовьте питательную среду для бактерий.

Начните с инокуляции 500 миллилитров бульона Terrific Broth, дополненного стрептомицином в концентрации 50 микрограмм на миллилитр, пятью миллилитрами насыщенной культуры E. coli OP50. Поместите культуру на шейкер и инкубируйте в течение ночи при 37 °C.

На следующий день распределите культуру по десяти пробиркам объемом 50 мл. Затем поместите пробирки в центрифугу с охлаждением и центрифугируйте при 2 500 RCF в течение 20 минут. После центрифугирования ресуспендируйте каждый бактериальный осадок в 10 мл жидкой среды для выращивания нематод или NGM.

Горизонтально встряхните суспензии. Используйте лабораторный шейкер в течение 15 минут для ресуспендирования бактерий. Затем центрифугируйте бактериальную культуру при 2 500 RCF при температуре четыре градуса Цельсия в течение 20 минут.

Слейте NGM и взвесьте бактериальный осадок. Затем добавьте равный объем буфера NGM и ресуспендируйте осадок с помощью вортекса. В завершение отберите аликвоты по 3 мл ресуспендированной бактериальной культуры в пробирки объемом 15 мл и храните их при температуре -20 °C до использования.

В данной демонстрации в качестве примера будет измерено влияние стресса, индуцированного Xeno Duke loan, на транскрипционный фактор Sskn one. Известно, что Sskn one активирует цитопротективные гены при окислительном и ксенобио-стрессе. Подготавливается крупномасштабная культура линии Trenchgenic c gans VP 5 96, содержащая две флуоресцентные конструкции.

Черви VP 5 96 экспрессируют как промотор GST-4, который управляет GFP и используется для мониторинга активности транскрипционного фактора Sskn-1, так и промотор DOP-3, который управляет RFP и используется в качестве стандарта для нормализации количества червей.

DOP 3 является промотором дофаминового рецептора и конститутивно экспрессируется в нейронах по всему организму. В данном примере, поскольку ксенобиотик сильно активирует sskn 1 и увеличивает количество GFP, экспрессируемого с промотора GST 4, для подготовки культур начните с объединения 150 мл буфера NNGM, 1,5 мл LB, 150 мкл 1 М холестерина и 75 мкл стрептомицина в концентрации 100 мг/мл. Добавление LB помогает предотвратить прилипание червей к стеклянной и пластиковой посуде, но этого количества недостаточно для поддержания роста бактерий.

Профильтруйте смесь для стерилизации, затем перенесите ее в стерильную колбу объемом один литр и отставьте колбу в сторону, чтобы яйца вышли из взрослых особей GR. Удалите бактерии с червей путем центрифугирования с последующей заменой среды NGM до тех пор, пока супернатант не станет прозрачным. Промойте червей второй раз, ресуспендировав их в стерильной воде, и снова центрифугируйте после осаждения.

Удалите супернатант и наполните пробирку 3.75 milliliters стерильной воды. Добавьте один milliliter бытового отбеливателя и 250 microliters 10 N гидроксида натрия, после чего немедленно перемешайте содержимое, перевернув пробирку пять-шесть раз. Поместите пробирку в ротатор после того, как черви выдерживались в отбеливателе в течение четырех минут.

Поместите пробирку под стереомикроскоп. Большинство взрослых особей должны подвергнуться лизису. Интенсивно встряхните пробирку 15–20 раз, чтобы помочь лизировать оставшихся взрослых червей; после того как лизис продолжался в общей сложности пять минут, добавьте стерильную воду, пока пробирка не заполнится.

Перемешайте содержимое путем переворачивания пробирки пять-шесть раз для сбора яиц. Центрифугируйте пробирку в течение одной минуты при 500 RCF. Промойте яйца трижды с помощью Resus, ресуспендируя их в 10 milliliters стерильной воды, центрифугируя и удаляя супернатант.

Затем разведите пробу яиц объемом 100 µL в 100 раз, добавив 10 mL буфера NGM. После этого с помощью пипетки нанесите три аликвоты по 5 µL на крышку чашки Петри под микроскопом. Подсчитайте количество яиц в трех отдельных аликвотах по 5 µL.

Для оценки общего количества яиц добавьте от 200 000 до 2 миллионов яиц в колбу с буфером NGM и перемешивайте культуру при 100 RPM и 20 °C. По прошествии не менее 16 часов после добавления яиц в колбу с помощью стерильной серологической пипетки отберите приблизительно 0,5 мл суспензии культуры червей.

Пипеткой нанесите три капли по 5 µL на стерильную крышку чашки Петри. Поместите крышку в морозильную камеру при температуре -20 °C на 1–2 минуты до парализации червей. После парализации червей подсчитайте среднее количество вылупившихся живых особей на 5 µL с помощью стереомикроскопа для оценки общего числа.

Разморозьте предварительно подготовленную замороженную бактериальную культуру OP 50, оставив ее на столе на несколько минут. Затем добавьте три миллилитра 50% OP 50 на 500 000 вылупившихся червей. Встряхивайте колбу со скоростью 100 RPM при температуре 20 °C.

Черви разовьются до стадии личинок L4 и молодых взрослых особей примерно через 51 час. На протяжении всего периода инкубации контролируйте количество бактерий с помощью визуального осмотра. Добавьте больше бактерий, если среда станет прозрачной.

С помощью стерильной серологической пипетки перенесите примерно 0.5 milliliters суспензии культуры червей на стандартный агарный планшет NGM. Осмотрите червей под стереомикроскопом, чтобы убедиться, что большинство из них являются личинками стадии L4 и молодыми взрослыми особями; при светлопольной микроскопии у личинок L4 в центре тела будет видать прозрачное вентральное пятно. Молодые взрослые особи будут немного крупнее, и у них не будет этого прозрачного пятна.

Затем перенесите культуру червей в стерильные пробирки объемом 50 мл. Поместите пробирки в штатив в вытяжном шкафу и дайте невылупившимся яйцам или недоразвитым червям осесть на дно. Они оседают медленнее, чем развитые черви.

Через 10 минут удалите супернатант, содержащий невылупившихся и недоразвитых червей, путем аспирации, затем добавьте примерно 10 milliliters буфера NGM к каждому осадку и суспендируйте червей, осторожно вращая пробирки. Соберите всех червей в одну пробирку объемом 50 milliliter. Центрифугируйте в центрифуге с поворотными роторами при 500 RCF в течение 30 секунд.

Затем ресуспендируйте червей в 50 миллилитрах NGM с 1%lb для промывки. Повторите эту процедуру, промыв червей три или четыре раза для удаления бактерий. Доведите объем NGM с буфером LB в пробирке до 50 миллилитров.

Перелейте эту смесь в специальную колбу для дозирования червей с магнитной мешалкой и установите её на магнитную перемешивающую пластину. Для заполнения мертвого пространства дозирующей колбы и кассеты дозатора требуется минимум около 20 мл или 60 000 червей. Подсчитайте количество червей в трех каплях по 5 µL, как было показано ранее.

После подсчета в среде NGM с добавлением LB до концентрации 12–15 червей на каплю объемом 5 мкл, для каждого планшета на 384 лунки потребуется около 35 000 червей или 11,5 мл суспензии червей. Установите в диспенсер кассету для дозирования объемом 10 мкл и стерилизуйте ее, промыв 70% этанолом. Удалите остатки этанола, промыв кассету стерильной водой.

Вставьте конец дозирующей кассеты в колбу так, чтобы она находилась непосредственно над магнитным перемешивателем, не препятствуя его движению. Убедитесь, что черви остаются во взвешенном состоянии по всему объему колбы. Запрограммируйте дозатор на выдачу червей на низкой скорости с двумя предварительными импульсами для заполнения системы (прайминга) и пропустите не менее 10 milliliters суспензии червей.

Быстро заполните микротитрационные планшеты, в которых уже должны находиться тестируемые соединения, чтобы предотвратить оседание червей в трубках. На этом этапе используется тестируемое соединение, предварительно внесенное в микротитрационный планшет. Glow. Загерметизируйте планшеты воздухопроницаемой лентой, чтобы предотвратить попадание пыли в лунки.

Поместите планшеты на встряхивающую платформу в инкубаторе при температуре, соответствующей данному анализу. Не складывайте планшеты друг на друга, так как это может ограничить поток воздуха. Поместите целевой планшет в микропланшетный ридер для измерения интенсивности флуоресценции в каждой лунке при соответствующих длинах волн возбуждения и эмиссии.

Для GFP используются фильтры с возбуждением при 4 85 и эмиссией при 5 28. Для RFP используются фильтры с возбуждением при пять 40 и эмиссией при пять 90. После считывания планшета рассчитайте отношение GFP к RFP и нормализуйте его по показаниям контрольных лунок, не содержащих активирующее соединение, чтобы определить точную кратность различия интенсивности флуоресценции, полученную в результате отдельных воздействий.

В представленном здесь анализе SSKN используется штамм с хромосомно интегрированным двойным репортером, при котором черви подсчитывались вручную с помощью стереомикроскопа. Количество червей коррелировало с дозированным объемом со значением R-квадрат 0,94 и значением p менее 0,0001. Это указывает на то, что количество червей, дозируемых в каждую лунку, можно контролировать путем регулировки дозируемого объема.

Общая флуоресценция GFP на лунку, показанная слева, и флуоресценция RFP на лунку, показанная справа, высоковоспроизводимы от лунки к лунке на 384-луночном планшете на данных рисунках. XS указывают относительную флуоресценцию, измеренную в каждой лунке. Сплошные линии обозначают средние значения, а пунктирные линии — три стандартных отклонения выше или ниже среднего значения флуоресценции всех лунок; коэффициент вариации составил менее 9%. Как показано на этом рисунке, флуоресценция GFP от промотора GST4 линейно коррелирует с флуоресценцией RFP от промотора DOP3 в 384 лунках при значении R² 0,62 и p-значении менее 0,0001.

Таким образом, неиндуцибельный RFP-репортер может быть использован для нормализации индуцибельного GFP-репортера. При таком подходе соотношение флуоресценции GFP к RFP становится высоковоспроизводимым между лунками в пределах одного 384-луночного планшета.

Расчет соотношения GFP к RFP позволил снизить коэффициент вариации до уровня ниже 6%, что демонстрирует способность репортера RFP с тремя промоторами DOP к снижению вариабельности, как показано здесь. Индукция GFP относительно RFP при воздействии активирующего ксенобиотика на клетки SK N one является стабильной и высоковоспроизводимой по всему 384-луночному планшету; средние относительные коэффициенты флуоресценции для всех контрольных лунок и лунок с due GLO отмечены сплошными линиями. Три стандартных отклонения выше среднего значения контроля и ниже среднего значения dlo отмечены пунктирными линиями.

После освоения метода запуск культуры червей занимает около одного часа в первый день, а последующий сбор и дозирование червей при правильном выполнении занимают около двух часов. При выполнении данной процедуры важно помнить, что следует начинать как минимум с 60 000 червей и поддерживать их во взвешенном состоянии во время дозирования; после разработки данного метода аналогичный скрининг, например, репортерных линий для других индуцибельных путей, может быть проведен с целью создания модуляторов для этих путей.

Данный метод может открыть перед исследователями в области высокопроизводительного скрининга и биосенсорики возможности для быстрого выявления низкомолекулярных модуляторов сигнальных путей или обнаружения загрязнителей окружающей среды. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как культивировать, дозировать и измерять флуоресцентные штаммы *elegans* для высокопроизводительного скрининга индуцибельных транскрипционных путей или тестирования множества образцов на наличие загрязнителей окружающей среды.