ReAsH / Flash Маркировка и анализ изображений белков Tetracysteine ​​датчика в клетках

Общая цель данной процедуры заключается в мечении клеток, экспрессирующих белок с тетрацистеиновым и флуоресцентным тегами, с помощью красителей flash или ash, а также в количественном анализе результатов. Это достигается путем трансфекции в интересующую клеточную линию плазмиды, несущей флуоресцентный белок и целевой белок, содержащий тетрацистеиновый тег. Затем экспрессированный белок метят красителями R или flash, после чего неспецифически связавшийся краситель удаляют путем промывки BAL для подготовки к микроскопической визуализации.

Затем с помощью конфокального микроскопа получают флуоресцентные изображения клеток в каналах ash или flash и флуоресцентного белка. В завершение изображения анализируют с помощью программы ImageJ для количественной оценки связывания ash или flash с целевым белком. В итоге можно получить результаты, демонстрирующие степень связывания ash или flash с целевым белком в клетках путем корреляции флуоресценции ash с флуоресценцией флуоресцентного белка.

Основным преимуществом данного метода по сравнению с существующими подходами, такими как простое мечение целевого белка GFP, является возможность отслеживать второе свойство белка, например конформационные изменения, в дополнение к его локализации. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области изучения субструктуры и функции белков, такие как события олигомеризации, конформационные перестройки и события связывания лигандов, которые изменяют способность TAC к затуханию или вспышкам. Идея этого метода возникла у нас, когда мы захотели оценить, как в клетках формируются малые субмикроскопические полигоны мутантного белка Huntington.

Визуальная демонстрация данного метода имеет критическое значение, так как этапы анализа данных сложно освоить из-за их технической сложности. Демонстрация экспериментальных процедур: этапы с первого по третий представит Ясмин Рансон, лаборант-исследователь нашей лаборатории, которая продемонстрирует анализ данных. Четвертый этап представит Севки Ган, аспирантка нашей лаборатории. Используйте стандартные методы культивирования клеток для интересующей вас клеточной линии и предметное стекло для имиджинга живых клеток, подготовленное к трансфекции.

Подготовьте культуру адгезивных клеток и трансфицируйте их плазмидой, содержащей ген интересующего белка с TC-меткой. В зависимости от выбранного метода трансфекции, важно предусмотреть положительный и отрицательный контроли, чтобы оценить степень специфического связывания с TC-метками, а также оценить перетекание флуоресценции между каналами при получении конфокальных микрофотографий. Таким образом, для двухцветного окрашивания убедитесь, что подготовлены образцы с одиночными цветами: либо только с флуоресцентным белком, либо, по возможности, с белком T ctech, связанным с флуорофором или иным аналогичным агентом.

Но без флуоресцентного белка. Через один-два дня после трансфекции осторожно промойте клетки 300 µL предварительно подогретого сбалансированного солевого раствора Хэнкса (HBSS); для этого приготовьте свежий подогретый HBSS с добавлением 10 µM 1,2-этандитиола (EDT) и 1 µM ASH. После удаления HBSS с клеток осторожно добавьте 300 µL среды с ASH и инкубируйте в течение ровно 30 минут при 37 °C в инкубаторе для культур тканей.

По нашему опыту, более длительное время инкубации значительно увеличивает фоновую флуоресценцию. Осторожно аспирируйте маркирующий раствор с клеток и замените его 300 µL предварительно нагретого HBSS с 250 µM 2,3-димеркаптопропанола или BAL на 15 минут при 37 °C. Удалите промывочный раствор путем осторожной аспирации и замените его 300 µL предварительно нагретого HBSS.

После этой промывки клетки можно зафиксировать параформальдегидом, хотя мы обнаружили, что это увеличивает неспецифическую цитофлуоресценцию. Поэтому обычно мы проводим визуализацию живых клеток при комнатной температуре. Кроме того, фиксация клеток перед маркировкой препятствует связыванию красителя.

Для начала визуализации клеток на конфокальном микроскопе настройте параметры съемки для каждого отдельного флуорофора и убедитесь, что перекрестное проникновение сигнала (bleed through) между каналами незначительно. Затем отрегулируйте настройки фотоумножителя таким образом, чтобы максимальная флуоресценция в образце не приводила к насыщению детектора. После определения оптимальных настроек визуализации не изменяйте их при переходе от одного образца к другому.

Используйте скорость сканирования 200 hertz, настройте усреднение по четырем линиям и установите диаметр пинхола на одну единицу площади. При недостаточном соотношении сигнал/шум диаметр пинхола можно увеличить, однако это может привести к некоторому снижению разрешения изображения.

По возможности собирайте конфокальные изображения в формате 12 бит или выше. Это позволит максимально повысить качество количественного анализа данных. Для всех образцов следует получить изображения как для канала флуоресцентного белка, так и для канала красителя BI arsenal.

Для анализа данных используйте программное обеспечение Image J со следующими плагинами. Если вы используете версию Image J старше 1.32 C, выберите следующие параметры. Чтобы разрешить одновременное открытие нескольких изображений, перейдите в edit options input slash output и отметьте поле use j file chooser to open slash share.

Нажмите «ОК». Откройте интересующие вас изображения. Image J автоматически определит максимальную и минимальную интенсивность пикселей, отображаемую на экране для каждого изображения в отдельности, поскольку разные изображения имеют разную интенсивность пикселей.

Это означает, что отображаемые изображения в текущем виде несопоставимы. Чтобы обеспечить одинаковый масштаб для всех открытых изображений, необходимо физически определить верхний и нижний пределы интенсивности пикселей для просмотра. Для установки этих значений выберите изображение, затем перейдите в раздел «яркость/контрастность» (brightness/contrast).

Нажмите «set» и задайте минимальное и максимальное отображаемые значения. Затем выберите «propagate to all open images» и нажмите «okay». В качестве альтернативы можно объединить все изображения для конкретного канала в один файл или стек.

Затем Image J автоматически приведет все изображения к одному масштабу. Для этого выберите image stacks, укажите изображения для объединения в стек, введите общее для каждого файла имя и выберите used titles as labels. Нажмите okay.

Преобразуйте все открытые изображения в восьмибитный формат для анализа. Выбор восьмибитного типа изображения позволит масштабировать отображаемый диапазон в интервал от 0 до 255. Важно не сохранять файлы поверх оригиналов в 12-битном или более высоком формате, так как это приведет к потере информационного содержания.

Сохраните копию в новой папке с названием «eight bit converted», используя опцию «Сохранить как». Одним из способов оценки степени связывания красителя биарзала на всем изображении является построение графика корреляции интенсивности пикселей. На этом графике значение каждого пикселя в одном канале откладывается относительно соответствующего значения пикселя во втором канале.

Таким образом, положение пикселя с высокой флуоресценцией GFP также будет характеризоваться высокой флуоресценцией ash при наличии сильного связывания. Для анализа кокорреляции пикселей убедитесь, что 8-битные изображения REA и GFP открыты в ImageJ. Затем откройте плагин Image Correlator, выбрав Plugins > Image Correlator. Назначьте файлы изображений как Image 1 и Image 2.

Затем нажмите «ОК». В результирующем стеке может не отображаться подробная информация. Это нормально.

Сохраните стек в новой папке с названием scatterplots, присвоив файлу то же имя, что и образцу, к которому он относится. Например, Ash GFP Correlation plot. Чтобы просмотреть данные, выберите один из двух вариантов.

Сначала преобразуйте данные в логарифмический формат, выбрав process math log auto. Затем для визуального изменения масштаба данных нажмите image adjust brightness slash contrast и выберите auto. Во-вторых, измените визуальный масштаб данных так, чтобы отображались только низкие значения, и выведите данные с использованием специальной таблицы поиска (LUT) для создания пользовательской LUT.

Нажмите на функцию редактирования цвета изображения LUT, чтобы создать очень простую таблицу LUT. Нажмите на верхний левый пиксель и выберите черный цвет. Затем выберите следующий пиксель справа и выберите красный цвет.

Затем нажмите на третий пиксель и, удерживая кнопку мыши, протяните выделение до нижнего правого пикселя. Выберите красный цвет, нажмите «ОК», затем выберите белый цвет и снова нажмите «ОК». Установите диапазон яркости/контрастности от 0 до 255, как описано ранее, чтобы зафиксировать изображение в соответствии с тем, что отображается на экране.

Преобразуйте изображения в формат RGB, чтобы иметь возможность копировать и вставлять их в другие программы. Сначала откройте 8-битные или 16-битные изображения, как было описано ранее. Назначьте изображениям GFP цветовую схему LUT.

Назначьте зеленую таблицу поиска (LUT), нажав на изображение. Таблицы поиска: green. Наконец, выберите изображение для копирования и скопируйте его в буфер обмена, выбрав «edit copy to system». На данном рисунке представлен типичный результат для киназы sock, слитой с GFP и TC-тегом, которую окрашивали в течение 30 минут.

При использовании ash в клетках HEC 2 9 3 видно, что ASH с высоким сродством эффективно связывается с целевым белком, имеющим TC-метку. Напротив, на данном рисунке представлен соответствующий контрольный образец SARK, слитого с GFP, но не имеющего TC-метки, что необходимо для проверки как специфичности TC-метки, так и уровня фонового окрашивания. Этот результат показывает, что RH не проявляет реактивности по отношению к целевому белку без TC-метки, что указывает на специфичность TC-метки для связывания SSH.

При выполнении данной процедуры важно следить за тем, чтобы клетки не достигали состояния конфлюэнтности и покоя, так как это повлияет на связывание V в клетках. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как проводить простой количественный анализ ваших данных; вы можете усовершенствовать эти методы для разработки собственных уникальных IUTS для визуализации данных.