Флуоресцентные наночастицы для измерения концентрации ионов в биологических системах

Общая цель следующего эксперимента заключается в изготовлении натриевых наносенсоров для применения in vitro и in vivo. Это достигается путем приготовления оптосмеси, содержащей компоненты сенсоров для наносенсоров. На втором этапе ПАВ подвергают ультразвуковой обработке в водном растворе для обеспечения равномерного распределения, что позволит сформировать наносенсоры при добавлении оптосмеси.

Затем к водному раствору поверхностно-активных веществ под воздействием ультразвука добавляют оптическую смесь для формирования наносенсоров в растворе. В данном видео демонстрируется, что отклик сенсора является регулируемым. Сенсоры можно вводить путем микроинъекций в кардиомиоциты, а также вводить мышам подкожно.

Главным преимуществом данной методики перед существующими методами, такими как флуоресцентные индикаторные красители, является возможность настройки сенсоров на динамический диапазон, соответствующий физиологической среде, измерение более широкого спектра аналитов и проведение рациометрических измерений для количественного анализа. Как правило, специалисты, впервые использующие этот метод, могут столкнуться с трудностями, так как после изготовления сенсоров процесс их введения в биологическую среду может показаться сложным. Запасы сухого sodium ion four x, сухого sodium TFPB и chromo four three необходимо подготовить до начала изготовления оптосенсоров в соответствии с письменным протоколом.

В вытяжном шкафу поместите все материалы в стеклянный флакон объемом 1,5 мл. Закрутив крышку с тефлоновым покрытием, осторожно перемешайте содержимое на вортексе до полного растворения ПВХ. Раствор должен приобрести красный цвет.

Начните изготовление наносенсоров, добавив 100 µL PEG-липида в концентрации 10 mg/mL в стеклянный флакон объемом 4 г. Затем добавьте 4 mL соответствующего водного раствора, например, 10 mM HEPES.

С помощью лабораторного домкрата погрузите наконечник ультразвукового зонда на 7 mm в виалу и примените низкую мощность ультразвуковой обработки в течение 30 секунд. В пробирку объемом 0,6 ml с помощью пипетки внесите 50 µL оптоматериала и 50 µL дихлорметана, обеспечив равномерное перемешивание. Затем начните ультразвуковую обработку продолжительностью три минуты.

В начале соникации добавьте 100 µL опто-смеси, погрузив наконечник пипетки и введя весь объем одним быстрым равномерным впрыском. Раствор станет синим, если pH поднимется выше 7 и если в системе нет натрия для удаления остаточного THF и дихлорометана из раствора. Переместите наконечник ультразвукового излучателя на глубину 2 мм.

По истечении оставшихся трех минут раствор станет непрозрачным. После завершения соникации наберите раствор наносенсоров в шприц объемом 5 мл. Установите фильтр и перенесите раствор наносенсоров в стеклянный флакон с завинчивающейся крышкой.

Начните с приготовления 10 растворов с постепенно увеличивающейся концентрацией натрия, по которым будет измеряться чувствительность наносенсора. Смешайте стоковые растворы натрия с концентрацией 0 M и 1 M в конических пробирках объемом 50 мл. Затем в 96-луночный планшет с оптическим дном внесите по 100 µL каждого раствора натрия в три лунки одного столбца.

Затем добавьте по 100 µL свежеприготовленных наносенсоров в каждую лунку, поместите планшет в микропланшетный флуориметр и введите длины волн возбуждения, эмиссии и отсечки, оптимальные для используемого хромофора. Выбор измеряемых длин волн зависит от конкретной задачи. Данные длины волн позволяют проводить измерения быстрой внутриклеточной динамики или снижать уровень шума.

Для получения значений альфа разделите отношение интенсивности при 570 нанометрах на интенсивность при 670 нанометрах или 680 нанометрах. Постройте график зависимости значений альфа от логарифма концентрации натрия, приняв логарифм нулевой концентрации натрия равным минус одному.

Теперь постройте сигмоидальную кривую по полученному отклику и на основании этой кривой рассчитайте концентрацию натрия, при которой значение альфа составляет 0,5. Это значение представляет собой концентрацию натрия, при которой сенсор работает оптимально. Используя эти данные, отрегулируйте соотношение sodium iono four x sodium TFPB и chromo iono four three в opto, чтобы создать наносенсоры с оптимальной концентрацией натрия.

Например, кривые отклика пяти различных наборов наносенсоров, представляющих разные опто-формуляции, различающихся только количеством натрия из четырех 10. Для внутриклеточной визуализации замените питательную среду клеток на прозрачную среду, такую как раствор Тиро, и перенесите клетки в камеру для визуализации. Теперь заполните подтянутую стеклянную пипетку раствором наносенсора, приготовленным в 5 mg/mL глюкозы в воде.

Затем закрепите пипетку в микроманипуляторе и подключите ее к системе инъекций с контролем давления. Опустите пипетку на клетку и введите ее в цитоплазму. Иногда требуется слегка постучать по держателю манипулятора, чтобы проколоть мембрану.

Введите несколько сотен пиколитров раствора наносенсора и быстро извлеките пипетку. Проведите анестезию мыши линии CD1 nude с помощью изофлурана в анестезиологической камере. После введения в состояние наркоза поместите мышь в дезинфицированную камеру для визуализации.

Затем наполните стерильный инсулиновый шприц с иглой 31G 10 µL наносенсоров с соответствующим значением KD в 10 mM PBS. Обязательно удалите все пузырьки воздуха с помощью пинцета. Захватите небольшую складку кожи на спине мыши в выбранном месте инъекции.

Введите шприц в кожу так, чтобы срез иглы был направлен вверх, а сама игла располагалась параллельно поверхности кожи. Затем потяните поршень шприца на себя, чтобы убедиться, что игла не попала в кровеносный сосуд. Для минимизации обратного давления осторожно перемещайте иглу вправо и влево, создавая в коже небольшое пространство.

Затем введите сенсоры и осторожно извлеките шприц. Слегка прижмите место инъекции и удалите раствор, который мог вытечь. Обычно вдоль спины делают шесть равномерно распределенных инъекций.

При работе с разными мышами замените иглу, чтобы минимизировать передачу заболеваний и перекрестное загрязнение. После инъекций получите изображения в светлом поле и флуоресцентные изображения, используя наборы фильтров, которые максимально соответствуют спектрам возбуждения и испускания наносенсоров. Это также позволяет минимизировать автофлуоресценцию кожи.

Эти кардиомиоциты новорожденных культивировали на покровном стекле и ввели в них наносенсоры на натрий. Данное флуоресцентное изображение получено при длине волны возбуждения 639 нм. Здесь представлено изображение тех же клеток в проходящем свете, а далее — совмещенное изображение обоих снимков.

Наблюдается некоторое кластерирование сенсоров, однако клетки сохраняют нормальную морфологию. Сенсоры диффундировали по всей цитозоли, ядерного накопления не наблюдается. На данном совмещенном изображении в светлом поле и флуоресценции показаны девять различных подкожных инъекций наносенсоров натрия в подкожное пространство обнаженной мыши.

Изготовление наносенсоров Masten занимает всего несколько минут при правильном выполнении; их можно применять в любых исследованиях для измерения обратимых колебаний концентрации аналита в режиме реального времени. После просмотра этого видео вы получите четкое представление о том, как вводить наносенсоры во внутриклеточное или подкожное пространство для проведения количественных измерений в биологической среде.