Лентивирус-опосредованной генетических манипуляций и визуализация Обонятельные сенсорные нейроны В естественных условиях

Одной из проблем при изучении развития в нейробиологии является визуализация морфологии дендритов и аксонов на уровне отдельных клеток in vivo. В обонятельной системе обонятельные сенсорные нейроны протягивают свои аксоны от обонятельного эпителия в носу к обонятельной луковице в головном мозге. Поскольку множество обонятельных сенсорных нейронов направляются к обонятельной луковице, они объединяются в пучки.

Это затрудняет изучение траекторий отдельных аксонов и морфологии их терминалей. Мы разработали метод визуализации единичных обонятельных сенсорных нейронов in vivo путем микроинъекции лентивируса, несущего конструкцию A GFP.

Успешная трансдукция лентивирусом позволяет визуализировать всю длину аксона обонятельной сенсорной нейронной клетки, включая терминальное разветвление. Помимо визуализации отдельных обонятельных сенсорных нейронов, данный метод позволяет манипулировать экспрессией конкретного интересующего гена для изучения его функции в условиях in vivo. Процедура с использованием лентивируса относится ко второму уровню биологической безопасности (BSL-2) и должна проводиться в ламинарном шкафу.

Для поддержания стерильности среды опрыскивайте 70% этанолом все предметы при помещении их в вытяжной шкаф; подготовьте и прогрейте водяную баню при 37 °C в течение как минимум 20 минут перед инъекцией. Наполните пластиковый пакет для хранения водой наполовину, запечатайте его и поместите на пустой нагревательный блок инкубатора.

Это позволит мышам восстановиться после инъекции. Наполните контейнер для биоопасных отходов 10% раствором отбеливателя для дезинфекции всех материалов, контактировавших с вирусом. В рамках данной процедуры подготовьте небольшую открытую емкость с 70% этанолом и вторую емкость со стерильной дистиллированной водой.

В ламинарном шкафу мы будем использовать шприц Hamilton объемом 5 µL с иглой 33G. Данная модель позволяет регулировать сопротивление плунжера с помощью регулятора натяжения, расположенного в верхней части камеры плунжера. Эта функция обеспечивает контроль объема микроинъекции для стерилизации иглы и камеры шприца.

Несколько раз повторите аспирацию и вытеснение этанола из чашки. Промойте картридж шприца, несколько раз аспирируя и вытесняя стерильную воду. Аккуратно отложите шприц в сторону внутри ламинарного шкафа.

Разместите спиртовые салфетки рядом с местом проведения инъекций. Подготовьте платформу для инъекций, представляющую собой приподнятую поверхность, которая облегчит позиционирование мыши. Для этого можно использовать перевернутую чашку Петри диаметром 10 см, застеленную салфетками Kim wipes.

Мышат можно анестезировать путем гипотермии до достижения возраста отъема. Отрежьте палец резиновой перчатки и поместите в него мышенка. Затем выдержите на льду в течение пяти минут.

Перчатка предотвратит ожоги кожи, которые могли бы возникнуть при прямом контакте с льдом; тест со льдом проводится для проверки полноты анестезии путем сжатия задних лап щенка, чтобы убедиться в отсутствии реакции животного. Теперь мы готовы к микроинъекции лентивируса. В качестве примера мы будем использовать новорожденного щенка.

При использовании мышей более старшего возраста вместо иглы 33-го калибра следует использовать иглу большего калибра, чтобы проникнуть сквозь поверхность черепа. Стерилизуйте поверхность носа мыши, протерев ее спиртовой салфеткой. Извлеките запасы лентивируса из морозильной камеры и разморозьте на льду.

Мы самостоятельно произвели лентивирус в лаборатории, используя установленные методы. При разработке данного метода мы обнаружили, что для обеспечения хорошей эффективности трансдукции требуется минимальный вирусный титр от 10⁹ инфекционных единиц на мл. Наберите два микролитра стокового раствора лентивируса в стерильный шприц Hamilton.

Поместите детеныша мыши на инъекционный столик. Захватите кожу на верхней части головы в области ушей и осторожно оттяните ее назад. Наш ламинарный шкаф оборудован диссекционным микроскопом.

Для точного направления микроинъекций осмотрите поверхность дорсальной части черепа в области переднего мозга, чтобы найти контуры обонятельной луковицы. Целевые зоны для наших микроинъекций находятся в непосредственной близости от обонятельной луковицы, но не должны включать саму луковицу. Каждому щенку делают четыре инъекции в обонятельный эпителий.

Эти позиции, отмеченные синими точками, требуют введения иглы под углом, направленным медиально. Дополнительные две инъекции, отмеченные зелеными точками, расположены в шахматном порядке, более медиально и антериорно по отношению к обонятельной луковице. Эти инъекции могут вводиться под углом в обе стороны.

Рекомендации по углам введения иглы даны с учетом вентрального расположения обонятельного эпителия, который в основном находится под обонятельной луковицей. Таким образом, перпендикулярный доступ ограничен. Введите иглу через верхнюю часть носовой полости примерно на три миллиметра ниже поверхности кожи.

Для достижения обонятельного эпителия. Опытный специалист должен почувствовать снижение сопротивления при попадании в просвет полости носа. Этой области следует избегать.

Введите микроинъекцией по 0,5 мкл стокового раствора вируса в каждую позицию. Снова выбрав по две точки с каждой стороны (как слева, так и справа), выполните в общей сложности четыре инъекции по 0,5 мкл. Таким образом, для каждой мыши в рамках одного сеанса инъекций потребуется два мкл вируса.

Снова будьте осторожны, чтобы не допустить попадания раствора вируса или крови, которые могут вытекать из места инъекции или ноздрей, на блот луковицы обонятельного нерва. Используя спиртовую салфетку, утилизируйте ее в контейнер с разбавленным раствором гипохлорита натрия, затем немедленно поместите мышь после инъекции в инкубатор с водяным матрасом для восстановления. Продезинфицируйте иглу шприца, повторив процедуру стерилизации, проведенную во время подготовки. Мышей после инъекции можно вернуть в клетку через 30 минут после восстановления в инкубаторе с водяным матрасом.

Всю процедуру микроинъекции можно повторить через четыре часа. Если вы хотите увеличить количество инфицированных обонятельных сенсорных нейронов, визуализировать их по всей длине клетки можно уже через три дня. Животных усыпляют и подвергают перфузии для наблюдения в выбранный временной точке.

Для визуализации траекторий и терминалей аксонов трансдуцированных единичных обонятельных сенсорных нейронов с использованием стандартных методов мы подвергаем обонятельную луковицу корональному расчленению и секционированию с толщиной среза 60 микрон. Таким образом, срез будет содержать все клеточные слои обонятельной луковицы, включая пучки аксонов обонятельных сенсорных нейронов и терминали аксонов, которые образуют синапсы в гломерулярных структурах, расположенных на поверхности луковицы, в качестве подготовки к методу плавающей иммуногистохимии. Выполняются серийные срезы обонятельной луковицы, которые затем вместе собираются в чашку Петри диаметром 10 сантиметров с пятью миллилитрами фосфатно-солевого буферного раствора.

Перенесите плавающие срезы в коническую пробирку объемом 50 мл. После того как срезы осядут на дно пробирки, удалите фосфатно-солевой буферный раствор с помощью вакуумного аспиратора. Будьте осторожны, чтобы не засосать срезы.

Добавьте 10 мл свежего буфера к срезам, чтобы вымыть остатки фиксатора или материала для заливки. Немедленно перенесите эту суспензию пипеткой в коническую пробирку объемом 15 мл, стараясь собрать все плавающие срезы; удалите раствор для промывки с помощью вакуума, затем обработайте срезы раствором 0,3% Triton X 100 в фосфатно-солевом буфере и поместите пробирку на шейкер (рокер) на 10 минут. При комнатной температуре можно приступить к стандартному протоколу иммуноокрашивания в той же конической пробирке, повторяя этапы вакуумного удаления и перемешивания на шейкере по мере необходимости для сосуда такого размера, оставляя объем 10 мл для этапов окрашивания и промывки.

Ниже приведен список антител, которые мы используем для совместного окрашивания позитивно трансдуцированных обонятельных сенсорных нейронов и общей популяции обонятельных сенсорных нейронов. Для обеспечения глубокого проникновения антител в срезы луковицы толщиной 60 микрон рекомендуется инкубация в течение ночи при температуре четырех градусов Цельсия. Продолжительность каждой промывки должна составлять не менее 20 минут.

Аккуратно распределите каждый срез на предметном стекле с помощью кисти и зафиксируйте каждое стекло с помощью среды Flora Mount G, дополненной раствором красителя для хроматина. Постарайтесь удалить все пузырьки воздуха из фиксирующей среды. Расположите срезы в ряды, чтобы упростить последующий этап скрининга.

Просканируйте эти срезы луковиц с иммуногистохимическим окрашиванием для поиска GFP-положительных аксональных волокон и окончаний. С помощью флуоресцентного микроскопа можно провести конфокальную микроскопию позитивно инфицированных нервных окончаний. Для калибровки фокальной плоскости в интересующей вас области рекомендуется использовать каналы DPI и белка-маркера обонятельного эпителия.

Эти результаты демонстрируют одиночное аксональное волокно и терминаль обонятельного сенсорного нейрона внутри гломерулы; CO с белком-маркером обонятельного анализа окрашен в красный цвет, а vlu two в сером — это инфицированные тела клеток обонятельных сенсорных нейронов, их дендритные головки также могут быть визуализированы в обонятельном эпителии, если эта ткань была включена в этапы диссекции и иммуноокрашивания. Данная конфокальная проекция обеспечивает детальное изучение морфологии пути аксонального продолжения и терминального дерева одного обонятельного сенсорного нейрона. Можно наблюдать, как аксональное волокно загибается обратно к своей гломерулярной мишени, а также детали структуры его ветвления внутри нейропиля гломерулы.

Метод лентивирусной микроинъекции позволяет визуализировать аксоны отдельных клеток и морфологию обонятельных сенсорных нейронов, а также проводить исследования по манипулированию экспрессией генов, поскольку трансдукция лентивирусом приводит к стабильной интеграции конструктов в геном. Лентивирус не инфицирует соседние клетки синаптическим путем. Визуализация может быть достигнута всего за три дня; подтверждено, что она сохраняется в течение как минимум трех месяцев и, вероятно, более длительные периоды.

Обонятельные сенсорные нейроны плохо инфицируются при назальном введении раствора лентивируса. Поэтому в данной процедуре требуется микроинъекция через поверхность. Таким образом, это наша процедура микроинъекции лентивируса.

Надеюсь, эта информация окажется полезной в получении собственных морфологий одиночных клеток. Желаю успехов в исследованиях.