Асептики лаборатории: Покрытие методы

[Диктор] Данный протокол включает применение асептических методов посева, используемых для выделения, размножения или количественного определения микроорганизмов, таких как бактерии и фаги. Процедуры включают метод посева штрихом для выделения единичных колоний бактериальных культур. Метод посева в разлитый агар для определения концентрации бактерий. И метод посева путем втирания для подсчета жизнеспособных бактериальных колоний. Послойный посев в мягкий агар используется для выделения фагов и подсчета бляшек, в то время как репликационный посев позволяет переносить клетки с одной чашки на другую с сохранением идентичного пространственного расположения. В конечном счете, практическое применение этих методов культивирования микроорганизмов варьируется от идентификации бактерий в окружающей среде до технологических достижений в области молекулярной генетики и высокопроизводительного биоанализа.

- Как правило, люди, которые только начинают осваивать эти методы посева, могут испытывать трудности, поскольку манипуляции требуют осторожных и скоординированных движений с целью избежания контакта с нестерильными поверхностями. Обучение этим рутинным процедурам требует подготовки и практики. Демонстрировать данные процедуры будет координатор моей лаборатории, доктор Крис Редди.

- [Narrator] Начните работу с микроорганизмами с ознакомления с правилами лабораторной техники и мерами предосторожности, включая классификацию биоопасности, дезинфекцию отходов и их утилизацию. Убедитесь, что все инструменты, растворы и среды для посева стерильны. Также подготовьте чистое рабочее место. Очистите его дезинфицирующим средством. Установите горелку Бунзена, подключенную к газовой линии, и подготовьте необходимые материалы с соответствующей маркировкой. Затем тщательно вымойте руки с антисептическим мылом и теплой водой. Сначала смочите руки теплой проточной водой, затем нанесите и тщательно распределите мыло. Энергично разотрите руки, создавая трение на всех поверхностях, включая большие пальцы, тыльную сторону пальцев, тыльную сторону кистей и пространство под ногтями. Затем тщательно сполосните руки, чтобы удалить остатки мыла, и вытрите их бумажными полотенцами из диспенсера. Наконец, используя новое бумажное полотенце, закройте кран. Метод посева штрихом предназначен для выделения чистых культур бактерий или колоний из смешанных популяций путем простого механического разделения. Достаньте чашку с агаром из холодильника с температурой 4 °C и выдержите ее при комнатной температуре для прогрева. Выберите подходящий инструмент для посева штрихом. Убедитесь, что поверхность чашки сухая и на крышке нет конденсата. Подпишите дно чашки с агаром по краю. При наличии навыка можно использовать одну чашку для нескольких образцов. Затем зажгите горелку Бунзена, чтобы простерилизовать металлическую петлю. Начните в 3–4 дюймах от металлической петли, поместив проволоку в кончик синего конуса — самую горячую часть пламени горелки Бунзена. Когда металл раскалится докрасна, переместите проволоку так, чтобы пламя охватило петлю. Чтобы охладить петлю, коснитесь края агаровой среды; при этом должен возникнуть шипящий звук. Продолжайте, чтобы захватить инокулят на петлю. Приподнимите нижнюю часть чашки. Перемещайте петлю вперед-назад от края к центру в первом квадранте чашки. Поставьте перевернутую чашку обратно на крышку. Снова простерилизуйте металлическую петлю в пламени. Поверните чашку Петри на 90 градусов. Коснитесь петлей конца последнего штриха, используя движение вперед-назад, пересеките последнюю половину штрихов в первом квадранте, затем перейдите в пустой второй квадрант. Как только второй квадрант будет заполнен, поставьте чашку на стол. Повторите процедуру посева для третьего и четвертого квадрантов, избегая контакта с первым квадрантом. Для посева стерильной плоской зубочисткой осторожно держите узкий конец большим и безымянным пальцами под углом 10–20 градусов к среде, используйте широкий конец для штрихования квадрантов. Между квадрантами переворачивайте чашку обратно на крышку и утилизируйте зубочистку надлежащим образом. После этого инкубируйте посеянные чашки в перевернутом виде. Метод посева в толщу среды позволяет подсчитать общее количество колониеобразующих единиц на поверхности и внутри агара одной чашки. Запустите таймер на 10 минут, затем перенесите 18 mL расплавленного агара из водяной бани при 55 °C в термоблок при 48 °C и выдержите в течение 10 минут. Подпишите дно стерильной чашки Петри. Если применимо, укажите коэффициент разведения. Теперь внесите 1 mL образца в центр чашки Петри. Закройте крышку. Снимите колпачок с пробирки с расплавленным агаром и простерилизуйте край открытой пробирки в пламени. Осторожно влейте агар в чашку Петри. Закройте крышку, затем смешайте образец с агаром, осторожно вращая чашку круговыми движениями. Подождите 30 минут, чтобы агар застыл. После застывания агара переверните чашку и поместите ее в теплое помещение. Посев путем распределения по поверхности направлен на разделение микроорганизмов, содержащихся в малом объеме образца, с равномерным распределением результирующих колоний по поверхности агара. Доведите чашку до комнатной температуры и надлежащим образом промаркируйте ее. Поместите чашку на поворотный стол. Пипетируйте 0.1 mL образца в центр агара и закройте крышку. Выбросьте наконечник в контейнер для отходов. Погрузите металлический стержень в стакан с 70% этанолом, полностью покрыв нижнюю часть распределителя и первый дюйм стержня, затем дайте жидкости стечь. Удалите излишки этанола, пронеся стержень через пламя горелки Бунзена. Затем откройте крышку чашки с агаром и охладите распределитель, прикоснувшись им к агару вдоль края. Медленно вращайте поворотный стол. Осторожно прижимая распределитель к поверхности агара, постепенно и равномерно распределяйте образец по всей чашке возвратно-поступательными движениями при вращении стола. Закройте крышку и дайте образцу полностью впитаться в течение минимум пяти минут. Затем инкубируйте перевернутую чашку. Сначала надлежащим образом подпишите чашку с агаром. Откройте крышку чашки. Затем откройте контейнер с предварительно стерилизованными стеклянными шариками и простерилизуйте край в пламени. Осторожно перенесите 10–12 стерильных стеклянных шариков на чашку с агаром. Закройте крышку чашки и простерилизуйте край контейнера с шариками перед тем, как закрыть его колпачком. Теперь пипеткой внесите образец в центр агара. Горизонтальными движениями осторожно встряхните шарики по поверхности агара семь раз. При правильном выполнении процедура напоминает звук маракасов. Поверните чашку на 60 градусов и снова встряхните горизонтально семь раз. Снова поверните чашку на 60 градусов и повторите встряхивание. Убедитесь, что образец впитался. Затем слейте загрязненные шарики в маркированный стакан с 10% раствором хлорной извести. Инкубируйте перевернутую чашку. Метод агаровых слоев (плак-тест) обычно используется для обнаружения и количественного определения бактериофагов. Вырастите индикаторные бактерии до экспоненциальной фазы и храните их на льду. Затем подпишите две стерильные микроцентрифужные пробирки «фаг» и «контроль» и добавьте в каждую 50 µL образца фага или буфера соответственно. Далее перемешайте бактериальную культуру в колбе, перенесите аликвоту бактерий в стерильную пробирку, осторожно перемешайте индикаторные бактерии на вортексе, затем добавьте по 500 µL бактерий в каждую пробирку для адсорбции. Смешайте, осторожно постукивая по пробиркам. Никогда не используйте вортекс или интенсивное пипетирование для образцов фагов. Инкубируйте смесь фаг-бактерии при температуре, подходящей для индикаторного штамма, в течение 20 минут. Тем временем перенесите две пробирки с мягким агаром из водяной бани при 55 °C в термоблок при 48 °C. Выдержите в течение 10 минут. Подпишите две чашки с питательным твердым агаром без конденсата, предварительно доведенные до комнатной температуры. Достаньте пробирку с мягким агаром из термоблока и проверьте, чтобы содержимое не было слишком горячим для прикосновения. Затем асептически перенесите смесь из пробирки для адсорбции фагов в пробирку с мягким агаром. После этого быстро вращайте пробирку между ладонями, чтобы перемешать содержимое. Держа пробирку в одной руке, откройте крышку чашки с твердым агаром другой рукой. Немедленно вылейте все содержимое пробирки на поверхность чашки с твердым агаром. Быстро и осторожно покачайте чашку. Закройте крышку и оставьте чашку на ровной поверхности на 30 минут до застывания мягкого агара. Затем повторите процедуру для контрольной пробирки, перенеся контрольную смесь в пробирку с мягким агаром, перемешав ее, вылив содержимое на чашку с твердым агаром, покачав ее и дав мягкому агару застыть в течение 30 минут. Осмотрите чашки на предмет образования плак. Чтобы выделить плак из гетерогенной смеси, осторожно проколите центр стерильной зубочисткой и перенесите инокулят в стерильную микроцентрифужную пробирку, содержащую 100 µL фагового буфера. Продолжайте очистку этого лизата, повторяя плак-тест от трех до шести раз с последовательными разведениями по мере необходимости. Репликационный посев использует селективный фенотип, позволяя сравнивать рост клеток на первичной чашке со вторичными чашками. Нанесите сетку на дно чашки, подпишите первичную чашку и пронумеруйте получившиеся квадраты. Теперь, используя асептическую технику, извлеките предварительно стерилизованную зубочистку из стакана, прикоснитесь центром каждого квадрата к образцу клеток и утилизируйте зубочистку в соответствующий контейнер для отходов. Инкубируйте первичную чашку. Сложите стопкой первичную чашку и все вторичные чашки. Поместите ориентирующую метку на боковую сторону нижней части чашек. Теперь извлеките стерильную бархатную ткань из упаковки и поместите ее на цилиндрический блок. Затем установите держатель, совместив метки на держателе с метками на блоке. Обратите внимание на ориентирующую метку на блоке и держателе. Затем снимите крышку с первичной чашки. Совместите ориентирующие метки на чашке и блоке. Опустите чашку так, чтобы поверхность агара соприкоснулась с бархатной тканью. Кончиками пальцев слегка, но равномерно нажмите на заднюю часть первичной чашки, а затем осторожно поднимите ее с блока. Убедитесь, что на бархате виден отпечаток клеток. Верните крышку на чашку. Теперь последовательно повторите протокол с бархатной тканью для каждой из вторичных чашек. Используйте бархатный отпечаток клеток с первичной чашки для инокуляции до восьми вторичных чашек, расположенных в порядке от наименее к наиболее благоприятному субстрату. Наконец, в качестве положительного контроля для последней чашки в серии используйте агаровую среду, на которой должны расти все тестируемые штаммы. Скрепите перевернутые чашки скотчем и инкубируйте их. Осмотрите вторичные чашки на наличие роста. Выключите горелку Бунзена, затем уберите все принадлежности. Поместите загрязненную лабораторную одежду, стеклянную посуду и опасные отходы в соответствующий контейнер для утилизации. Очистите рабочую зону дезинфицирующим средством. Наконец, тщательно вымойте руки с антисептическим мылом и теплой водой. Serratia Marcescens — это грамотрицательная палочковидная протеобактерия, вырабатывающая красноватый пигмент под названием продигиозин. Она часто встречается в ванных комнатах и на шторках для душа. В этом примере метод посева штрихом позволяет получить одиночные колонии в четвертом квадранте. Этот анализ бактерий, присутствующих в пробе воды, взятой из общественного питьевого фонтанчика, выполнен методом посева в толщу среды. Обратите внимание на различие во внешнем виде колоний. Поверхностные колонии крупные и имеют круглую форму, в то время как некоторые другие поверхностные колонии очень малы и имеют неправильную форму. Метод посева по поверхности является важным компонентом в экспериментах по обогащению, селекции и скринингу. Например, метод копакабана является дифференцирующим инструментом в классическом сине-белом скрининге в технологии рекомбинантной ДНК. Фаг T4 — это вирулентный фаг с двухцепочечной ДНК, который заражает своего хозяина Escherichia coli для лизиса и высвобождения дочерних фагов. Этот плак-тест на агаре EHA показывает фаги в зонах просветления диаметром примерно один миллиметр. В отсутствие инфицирующих частиц фага рост бактерий приводит к образованию мутной суспензии клеток в мягком агаре, в которой отдельные колонии не видны. При использовании метода наложения мягкого агара морфология плак может варьироваться. Например, здесь один и тот же штамм-хозяин mycobacterium дает различную морфологию плак в присутствии фагов destroyers против фагов MSSS. Сила репликационного посева заключается в одновременном скрининге большого количества микроорганизмов. В данном случае четыре штамма pseudomonas были протестированы в дубликате на рост на трех различных источниках углерода: ацетамиде, лактозе и глицине. Здесь первичная чашка представляет собой полную среду YTA, инокулированную четырьмя указанными штаммами. Штаммы демонстрируют различные паттерны роста на репликационных чашках с минимальной средой MSA, дополненной одним источником углерода: ацетамидом, лактозой или глицином. Все штаммы растут на последней контрольной чашке, подтверждая, что клетки были перенесены на все вторичные чашки в этой серии. Табличный анализ результатов репликационного посева подробно описывает одновременный скрининг различных штаммов дикого типа на характерные требования к росту.

- После просмотра этого видео вы должны хорошо понимать, как выполнять процедуры посева, не загрязняя среды или культуры, а также как выбирать подходящий метод посева для любой конкретной экспериментальной задачи в лаборатории. Овладение этими методами требует практики. Однако при правильном обучении процедуры посева, описанные в этом видео, станут привычными при работе за лабораторным столом.