Методы анализа внеклеточной везикул с использованием проточной цитометрии

Общая цель этой процедуры заключается в выделении и анализе циркуляции внеклеточных везикул в крови двумя различными методами. Для индивидуального метода обнаружения внеклеточных везикул. Бедная тромбоцитами плазма или PPP сначала выделяется из образца крови.

Затем PPP окрашивают представляющими интерес флюорохром-конъюгированными антителами. Для способа детекции, основанного на гранулах, внеклеточные везикулы инкубируют с гранулами, а затем связанные с гранулами везикулы окрашивают соответствующими конъюгированными антителами флуорохрома. В конечном счете, содержание циркулирующих внеклеточных везикул может быть определено путем анализа образцов с помощью проточной цитометрии.

Основное преимущество этого метода перед существующими методами, такими как электронная микроскопия или разделение магнитных шариков, заключается в том, что он намного быстрее и позволяет оценить общую внеклеточную популяцию эскалей, а не ограничиваться конкретными субпопуляциями. Как правило, люди, плохо знакомые с этим методом, будут испытывать трудности, так как успех этого метода требует строгого соблюдения продемонстрированных маневров и параметров настройки цитометра. Затем перелейте 1,2 миллилитровые аликвоты надосадочной жидкости плазмы в центрифужные пробирки объемом 1,5 миллилитров, стараясь не повредить нижние слои, содержащие охристую оболочку и эритроциты, затем снова центрифугируйте надосадочную жидкость, чтобы удалить любые тромбоциты и крупные фрагменты клеток.

В конце отжима осторожно перенесите все, кроме последних 200 микролитров образцов PPP, в новые пробирки, стараясь не потревожить гранулы. Затем перемешайте плазму вверх и вниз несколько раз и перенесите 320 микролитров каждого образца в верхний ряд 96-луночного планшета. Чтобы окрасить образцы, объедините антитела, представляющие интерес для каждой из трех панелей, в отдельные центробежные фильтрующие трубки с нулевой точкой 22 микрометра и открутите антитела с помощью односкоростной центрифуги с фиксированным углом.

Когда все антитела пройдут через фильтр, добавьте соответствующее количество смеси в каждую лунку 96-луночного планшета, как показано на рисунке. Затем с помощью многоканальной пипетки смешайте образцы PPP, а затем перенесите 100 микролитров каждого образца к антителам во втором ряду. Затем снова перемешайте образцы, поменяйте наконечники и перенесите по 100 микролитров образца в каждый из следующих двух рядов антител по мере необходимости.

Для эксперимента. Инкубируйте планшет при температуре четыре градуса Цельсия через 30 минут при концентрации 220 микролитров PBS на лунку, чтобы проложить ряды с шестого по восьмой в шкафу биологической безопасности. Затем с помощью регулируемой по ширине многоканальной пипетки перенесите содержимое каждой лунки в соответствующую центробежную фильтрующую трубку, не меняя наконечники.

Используйте 200 микролитров PBS из одного из рядов промывки, чтобы промыть лунки, из которых только что были извлечены пробы. Затем переложите промывочный раствор на те же фильтры, в которые ранее были добавлены образцы СЗР, и закройте центробежные фильтры. После того, как все окрашенные образцы PPP будут перенесены вместе с растворами для промывки, раскрутите образцы в центрифуге с неподвижным ротором.

После отжима убедитесь, что на фильтрах не осталось жидкости. Затем суспендируйте верхние части фильтров в 300 микролитрах PBS и перенесите ресуспендированное содержимое в предварительно помеченные пробирки для немедленного проточного цитометрического анализа. Промывка окрашенных образцов с помощью центробежных фильтров, усиливает разделение между фоновыми и положительными маркерными сигналами.

Однако важно отметить, что некоторые из более мелких внеклеточных везикул, включая экзосомы, могут быть потеряны через дверцы фильтра. Чтобы проанализировать образцы, сначала установите параметры напряжения прямого и бокового рассеяния на логарифмическую шкалу и выберите самые низкие пороги, допустимые цитометром для каждого параметра. Затем, во время работы трубки с нулевой целой 22 микрометрами, отфильтрованная PBS регулирует эти напряжения до максимальных значений, исключающих большую часть фонового шума. Затем проведите пробирку, содержащую смесь бусин, размером в один микрометр и меньше, и нарисуйте ворота вокруг популяции бусин на диаграмме рассеяния вперед, чтобы захватить все события под бусинами размером в один микрометр.

Теперь установите низкую скорость потока цитометра и с помощью бусин отрегулируйте регулятор скорости потока на цитометре до желаемой скорости события. Затем с помощью трубки из разбавленных в PBS радужных флуоресцентных частиц получают 5 000 событий, записывая среднюю интенсивность значений для прямого рассеивания на стороне рассеяния и каждого цветового канала. После завершения первого считывания для каждой пробирки смешайте 20 микролитров 10%MP 40 с каждым образцом и повторно считайте пробирки в течение того же времени, чтобы обеспечить вычитание положительных событий, обнаруженных в лизированном образце за равный период времени.

Чтобы обнаружить внеклеточные везикулы с помощью захвата на основе гранул, начните с двукратной промывки непокрытых шестимикрометровых гранул полистирола средой RPMI, а затем Resus в двух миллилитрах того же количества. Затем добавьте 6000 бусин в каждую новую факсимильную трубку, в отрицательную контрольную трубку в количестве 400 микролитров среды, во все остальные трубки в количестве 200 микролитров ППС или ультрацентрифуговых внеклеточных везикул, в зависимости от ситуации, и 200 микролитров среды. Отрегулируйте конечный объем в каждой трубке до 400 микролитров.

С большим количеством носителей. Инкубируйте пробирки в течение ночи при температуре четыре градуса Цельсия на шейкере. На следующее утро промойте бусины двумя миллилитрами среды.

Аспирируйте надосадочную жидкость и блокируйте любое неспецифическое связывание с помощью 400 микролитров 5% бычьего сывороточного альбумина, поместите в шейкер при температуре четыре градуса Цельсия на три часа. Через три часа промойте шарики еще в двух миллилитрах среды и повторно суспендируйте гранулы в 100 микролитрах свежей среды. Теперь отфильтруйте антитела и добавьте соответствующий объем отфильтрованного коктейля антител в каждую пробирку, а затем через 30 минут при четырех градусах Цельсия промойте шарики еще в двух миллилитрах среды.

На этот раз гранулы ресуспендируются в 400 микролитрах среды и сразу же анализируются образцы с помощью проточной цитометрии, регулируя параметры прямого внутреннего рассеяния до нижнего порога, допустимого проточным цитометром, как показано выше. Наконец, заберем популяцию синглетных бусин и получим 2000 событий на образец. Для обнаружения присутствия внеклеточных везикул в образцах PPP можно использовать как индивидуальные, так и основанные на гранулах методы детектирования, как показано на этих точечных диаграммах.

Большинство событий должно попадать в пределы ворот внеклеточного везикулы. Например, на этом рисунке эти графики параметров bi показали обнаружение маркеров CD 1 0 8 A и CD 2 35 A, которые являются двумя маркерами эритроцитов, которые, как известно, сосуществуют на клетках. Как и ожидалось, более половины положительных событий на внеклеточных везикулах являются положительными по обоим маркерам, в то время как на этих графиках параметров экспрессия внеклеточных везикул двух маркеров, которые, как известно, не сосуществуют на клетках, демонстрируют отдельные отдельные положительные популяции с использованием метода обнаружения, основанного на гранулах.

Разделения между положительными и отрицательными популяциями не существует, и события проявляются в двойных положительных квадрантах, хотя обычно они не обнаруживаются на одних и тех же типах клеток из-за того, что оба типа внеклеточных везикул связываются с одной бусиной. Таким образом, данные, полученные с помощью этого метода, лучше всего анализировать с использованием гистограмм, наложенных на отрицательные контрольные данные, с видимым сдвигом в экспрессии маркеров, наблюдаемым в образцах бисера по сравнению с контрольными образцами после освоения. С помощью этой методики можно проанализировать 12 образцов крови с тремя панелями антител за три-четыре часа при индивидуальном методе обнаружения или за полтора дня при правильном выполнении метода шариков.

При попытке выполнить эту процедуру важно помнить о последовательности в обработке каждого образца, убедиться, что скорость потока цитометра и интенсивность флуоресценции были правильно отрегулированы в начале каждого эксперимента в соответствии с настройками предыдущего дня, особенно при работе с несколькими образцами в течение нескольких дней.