Биоинженерия правам микрососудистой сети в иммунодефицитных мышей

Общая цель данной процедуры заключается в создании сосудистой сети человека in vivo. Это достигается путем предварительного культивирования эндотелиальных колониеобразующих клеток, полученных из крови человека, и мезенхимальных стволовых клеток, полученных из костного мозга человека. Затем оба типа клеток смешивают с гелем на основе коллагена, который вводят подкожно иммунодефицитной мыши.

Спустя семь дней имплантат извлекают и оценивают на предмет формирования человеческой сосудистой сети. В конечном итоге наличие специфических для человека микрососудов внутри имплантатов может быть подтверждено с помощью гистологии и иммуногистохимии. Основным преимуществом данной технологии перед традиционными методами, такими как хирургическая имплантация конструкции, является то, что она проста в исполнении и не требует хирургического вмешательства.

Начните с размораживания одной пробирки E CFCs и немедленно разведите клетки в конической пробирке объемом 15 миллилитров, содержащей 10 миллилитров DMEM. Центрифугируйте клеточную суспензию при 1200 RPM в течение пяти минут и ресуспендируйте осадок клеток в 10 миллилитрах теплой среды EGM two. Затем перенесите клетки в 100-миллиметровую чашку для культивирования тканей, покрытую 1% желатином, и инкубируйте клетки в течение ночи в увлажненном инкубаторе.

На следующее утро аккуратно аспирируйте среду и все несвязавшиеся клетки. Затем добавьте к связавшимся клеткам 10 мл свежей среды E GM two. Повторяйте эту процедуру в течение следующих нескольких дней до образования сплошного монослоя.

Затем промойте клетки 10 миллилитрами PBS. Замените PBS на два миллилитра трипсина-ЭДТА и верните планшет в инкубатор на пять минут. Через пять минут, используя микроскоп, осторожно постучите по планшету и проверьте, открепились ли клетки.

Если клетки не отделились, повторите краткие инкубации при осторожном перемешивании. После полного отделения клеток добавьте к ним 8 мл среды EGM two и перенесите клетки в коническую пробирку объемом 15 мл. Подсчитайте количество клеток и центрифугируйте их при 1200 RPM в течение пяти минут.

Теперь высейте клетки на планшеты для культивирования тканей, покрытые 1% желатином, с плотностью посева 5 000 клеток на квадратный сантиметр. Инкубируйте клетки в среде EGM two, обновляя среду EGM two каждые два-три дня. Повторяйте эту процедуру при последующих пассажах с четвертого по восьмой.

Клетки E CFC будут готовы к использованию. Данный протокол также может быть использован для культивирования MSC. Для этого просто замените среду E GM two на среду M-S-C-G-M.

Используйте непокрытую культуральную пластину. Начинайте пассирование при 80% конфлюэнтности и пересевайте клетки с плотностью посева 10 000 клеток на квадратный сантиметр. Для этого эксперимента требуется 800 000 E CFCs и 1 200 000 MSCs на один имплантат.

Как правило, одновременно подготавливают пять имплантатов. Для начала аспирируют питательную среду из культуральных планшетов и промывают каждый планшет с клетками 10 мл PBS. PBS заменяют двумя мл трипсина ЭДТА и инкубируют планшеты при осторожном встряхивании.

Каждые две-пять минут проверяйте клетки под микроскопом до тех пор, пока все они не отделятся. Затем добавьте 8 мл DMEM и соберите клеточную суспензию. В конической пробирке объемом 15 мл подсчитайте количество клеток и перенесите количество клеток, необходимое для пяти имплантатов, в отдельную коническую пробирку объемом 15 мл.

Затем центрифугируйте клетки при 1200 об/мин в течение пяти минут и удалите супернатант. Осторожно приготовьте смесь фибриногена и коллагенового фибронектина на льду. Затем очень аккуратно ресуспендируйте клеточный осадок в этой охлажденной смеси.

Избегая образования пузырьков воздуха, перенесите суспензию клеток в шприц объемом 1 мл и установите иглу 26G с колпачком. Храните заполненный шприц на льду до момента инъекции клеточной смеси. Четырех шестинедельных атимических мышей линии nude с иммунодефицитом подвергли анестезии в камере с изофлураном.

После того как мыши будут анестезированы и перестанут реагировать на защемление пальца, перейдите к инъекциям для каждой мыши. Используя иглу 30-го калибра, подкожно введите 50 µL раствора тромбина в верхнюю часть спины. В то же место введите 200 µL клеточной смеси.

При использовании иглы 26 Gauge введенные макромолекулы подвергнутся гелированию, в результате чего под кожей образуется небольшая, но заметная припухлость. После инъекции поместите мышей на слой марли для обеспечения комфорта и тепла. Наблюдайте за ними до тех пор, пока они не смогут самостоятельно передвигаться.

В течение следующих трех дней ежедневно наблюдайте за общим состоянием здоровья животного. Через одну неделю после инъекций эвтаназируйте мышей диоксидом углерода и хирургическим путем удалите гелевую пробку. После извлечения сфотографируйте гелевые пробки рядом с линейкой, затем поместите каждую пробку в гистологический кассет и оставьте их на ночь в 10% нейтральном буферном формалине при комнатной температуре.

На следующий день удалите 10% нейтральный буферный формалин, промыв образцы дистиллированной водой. Храните кассеты в PBS при температуре четыре градуса Цельсия до проведения гистологического анализа. Изготовьте срезы имплантата, залитого в парафин, толщиной семь микрон.

Затем количественно определите плотность микрососудов в средней части имплантатов. С помощью окрашивания гематоксилином и эозином подсчитайте количество сосудов на квадратный миллиметр, чтобы подтвердить человеческое происхождение микрососудов. Окрасьте срезы коммерчески доступными антителами к CD 31 человека в разведении 1:100.

На этом фазово-контрастном изображении видна характерная «булыжная мостовая» морфология эндотелиальных клеток в типичном сливном монослое eCFC, полученных из пуповинной крови. На данном изображении представлена типичная веретенообразная морфология МСК, полученных из костного мозга человека. После недельной инкубации в организме мыши-хозяина имплантат, отмеченный желтой пунктирной линией, при большем увеличении выглядел совершенно иначе, чем ткани хозяина.

Было выявлено несколько микрососудов, просветы которых содержали эритроциты; они отмечены желтыми стрелками. При иммуногистохимическом исследовании пробок просветы микрососудов проявили реактивность к моноклональным антителам к человеческому CD 31. Ядра клеток были докрашены гематином.

После освоения этой технологии, при правильном выполнении, процедуру можно завершить в объеме одной унции.