CD4 + T-лимфоцитов Захват Использование одноразовых микрофлюидный чип на ВИЧ

Здравствуйте, меня зовут Ричард Лин, я исследователь в группе профессора Т. И. Мерси в Отделении наук о здоровье и технологиях Гарвардского университета и Массачусетского технологического института (Harvard MIT Division of Health Sciences and Technology). Проект, над которым я работаю, посвящен количественному определению и захвату CD4-положительных и CD3-положительных T-лимфоцитов в крови пациентов для использования в условиях ограниченных ресурсов.

Перед нами микрофлюидное устройство, изготовленное из PDMS (полидиметилсилоксана). Высота самого канала составляет 50 µm, а общий объем устройства — 10 µL. Это высокоточное устройство, которое мы будем использовать для захвата T-хелперов (T-лимфоцитов).

По сути, это диагностический эталон для пациентов с ВИЧ. Таким образом, поверхность микрофлюидного устройства уже была подготовлена с помощью белка, а в шприце находятся антитела к CD4. В данный момент у нас есть только биологический буфер PBS с pH 7,4, который мы сейчас пропустим через канал, чтобы вымыть излишки антител к CD4.

На данном этапе контролировать скорость потока не требуется, так как наша цель — просто вымыть излишки вещества, и конкретная скорость не имеет значения. Здесь будут располагаться входные отверстия устройства, а здесь — выходные, слева от меня и справа от вас. Теперь я вымою излишки раствора антител; если вы посмотрите на выходное отверстие, вы увидите вытекающую жидкость. Объем очень мал, но при ближайшем рассмотрении заметно, что жидкость выходит из канала через трубку.

Теперь, когда мы удалили излишки раствора антител, можно подготовиться к введению крови. Я отсоединю трубку от входа. Теперь мы откроем новый шприц с кровью — цельной человеческой кровью.

Таким образом, это не образец пациента, а образец здорового человека, который мы подготовили для введения в микрофлюидное устройство. Мы закрепим шприц в шприцевом насосе. Теперь мы включим его, и вы увидите скорость потока шприца; мы установили её на уровне 5 µL в минуту.

Теперь мы подготовимся к инъекции крови. Мы установим шприцевой насос вертикально, так как, как известно, клетки крови оседают, и нам нужно, чтобы клетки поступали в канал. Таким образом, осадок клеток будет скапливаться в нижней части, непосредственно возле нашей трубки.

Теперь все готово к работе. Объем моего устройства составляет 10 µL на 10 µL. Объем, который мы хотим подать в канал, также составляет 10 µL.

Таким образом, я могу определить, достаточно ли крови введено, просто глядя на цвет канала: если он полностью заполнился красным цветом, значит, я ввел 10 µL и должен остановить толкатель шприца. Теперь я нажму кнопку пуска; иногда процесс начинается сразу, а иногда требуется некоторое время, прежде чем кровь действительно поступит в канал. Во многом это связано с давлением.

Например, когда мы устанавливаем шприц, мы можем набирать или вводить жидкость, чтобы отрегулировать объем крови в трубках. Это может занять некоторое время, но как только начнется перекачка в канал, скорость потока будет установлена на уровне ly в минуту, что и требуется. Поэтому здесь следует проявить терпение и подождать; иногда требуется две или три минуты, прежде чем кровь начнет поступать в канал.

Как видно, кровь начинает поступать в канал. Таким образом, можно сказать, что устройство практически полностью заполнено. Теперь мы переключим трубку обратно на PBS, чтобы вымыть кровь из канала.

Для этого мы повторим действия по удалению трубок, которые выполняли ранее. Поскольку нам по-прежнему необходимо контролировать скорость подачи PBS, шприцевой насос всё еще требуется. Однако, так как кровоток больше не используется, шприцевой насос не обязательно держать в вертикальном положении, поскольку в PBS отсутствуют клетки.

Теперь мы всё подготовили и приступим к промыванию устройства от крови; я снова нажму кнопку «sharp» прямо здесь. Как видите, устройство начинает очищаться. По краям всё еще остается немного крови, но она постепенно исчезает.

Как только вся кровь будет удалена, мы увеличим скорость с 5 µL в минуту до 20 µL в минуту. Причина этого изменения заключается в том, что в крови на самом деле присутствуют два типа клеток, имеющих C4-положительные антигены. Один из них — это те, которые мы ищем, T-хелперы.

Другие клетки — это так называемые моноциты. Мы хотим быть уверены, что наше устройство специфически захватывает только T-хелперы, а не T-хелперы и моноциты одновременно. Для этого мы увеличиваем скорость потока, поскольку известно, что моноциты крупнее по размеру, чем T-хелперы.

Таким образом, при увеличении скорости потока более крупные моноциты будут испытывать большее давление, заставляющее их покинуть поверхность, чем CD4-положительные T-хелперы. Таким образом, это займет примерно 20 минут. Сейчас у меня в руке раствор.

Это раствор для лизиса. В данном случае он предназначен для лизиса эритроцитов. Таким образом, все эритроциты, оставшиеся в канале, будут подвергнуты лизису этим раствором.

Этот раствор разведен в 10 раз от стокового раствора. Теперь мы остановим шприцевой насос, снимем трубку и заменим раствор на тот, что находится в этом шприце. Я останавливаю устройство, снимаю трубку, отсоединяю ее и заменяю на новую с этим шприцем.

Итак, теперь, когда все подготовлено, мы снизим скорость потока обратно до 5 µL/min. Для этого мы выберем значение скорости 20, изменим его на 5, и теперь будем подавать раствор для фиксации в течение 20 минут. Теперь нажимаем кнопку «Старт».

Перед нами оптическое изображение устройства при 10-кратном увеличении. Вы видите все эти белые точки. Как же нам убедиться, что это именно те клетки, которые мы ищем?

Таким образом, мы используем несколько различных красителей. Первый из них называется DAPI; он окрашивает ядра клеток. По сути, любые клетки с ядром, например лейкоциты, будут окрашены, в то время как эритроциты, не имеющие ядра, окрашены не будут. Это видно на всем изображении: повсюду видны синие точки, и каждая из них окрашена в синий цвет.

представляет собой клетку. Таким образом, следующим шагом является проверка клеток на наличие так называемого C four-положительного антигена. Это крайне важно, поскольку основной целью нашего устройства является захват C four-положительных клеток.

Далее, в качестве флуоресцентного антитела мы, разумеется, используем специфическое к C4. Перейдем к следующему слайду. На этом изображении клетки выглядят гораздо менее ярко, поскольку используемое нами флуоресцентное антитело обычно используется для фиксации.

Таким образом, степень разведения значительно выше. Однако при внимательном рассмотрении все еще заметно, что по всему полю зрения рассредоточены точки. Они довольно тусклые.

Однако при более детальном рассмотрении мы видим, что эти клетки положительны по CD4, что является благоприятным результатом, так как это именно то, что нам необходимо. Следующий этап проверки заключается в том, что, как я упоминал ранее, существуют два разных типа CD4-положительных клеток: одни — это искомые нами T-хелперы, а другие — так называемые моноциты.

Таким образом, нам снова необходимы другие флуоресцентные антитела, чтобы дифференцировать эти два типа клеток. Известно, что Т-хелперы экспрессируют антигены, которые мы называем CD3-положительными, в то время как моноциты их не имеют.

Следующее антитело, которое мы используем, специфично к CD3, что видно на данном изображении. Как и в предыдущем случае, заметно, что по всему устройству распределены точки; некоторые из них выглядят крупнее, так как иногда определенные клетки светятся ярче других. Иными словами, в данной ситуации многое зависит от случая, но в большинстве случаев эти яркие красные точки представляют собой клетки.

Итак, мы снова хотим убедиться, что наши клетки являются CD4-положительными и CD3-положительными. В данном случае видно, что многие из наших клеток CD3-положительны, что хорошо, так как это обеспечивает специфичность нашего захвата.

Эти крупные точки могут оказаться мусором, но зачастую бывает так, что клетка просто накопила на своей поверхности больше CD3. На этом изображении представлены одни из данных, которые мы собрали с помощью этого микрофлюидного устройства, которое по сути представляет собой систему захвата клеток. В предыдущих слайдах и других материалах вы могли заметить множество подобных изображений с клетками.

Но к чему в итоге приводят эти накопления? В результате формируется профиль захвата клеток, при котором по оси X мы откладываем расстояние от входа, а по оси Y — диск захвата клеток. Можно заметить, что по всему устройству плотность клеток изначально чрезвычайно высока, а затем постепенно снижается, что и ожидалось, так как мы захватываем C4-положительные и C3-положительные клетки из кровотока, и концентрация этих клеток в пробе крови будет снижаться.

И таким образом обычно представлены наши данные.