Чувствительности к антимикробным препаратам комплексного туберкулеза Mycobacterium для первого и второго ряда путем разведения в бульоне Формат планшет

Для лечения mycobacterium tuberculosis доступно относительно немного препаратов, поэтому развитие резистентности к любому из них вызывает серьезную обеспокоенность. В данной видеостатье описывается процедура одновременного тестирования антибиотикорезистентности M tuberculosis к 12 различным противомикробным препаратам. Таким образом, способность быстро выявлять антимикробную резистентность M tuberculosis имеет важное значение для сдерживания роста числа резистентных штаммов при тестировании чувствительности к антибиотикам.

M tuberculosis сначала выращивают на твердых или жидких средах для получения бактериальной суспензии. Готовят инокулят и вносят его в микропланшет, содержащий различные концентрации 12 препаратов, включая препараты первого и второго ряда. После инкубации степень роста в каждой лунке определяют либо вручную с помощью зеркального ящика, либо с помощью полуавтоматического планшетного ридера.

Полученные данные указывают на минимальную подавляющую концентрацию для каждого протестированного препарата и показывают, к каким антибиотикам устойчив исследуемый штамм TB. Эти результаты помогают выбрать подходящий препарат для лечения tb. Здравствуйте, меня зовут Нэнси Эк, я директор Лаборатории микобактериологии в клинике Майо в Рочестере, штат Миннесота.

Сегодня мы опишем метод определения чувствительности Mycobacterium tuberculosis к антибиотикам. Основным преимуществом данной методики перед существующими методами, такими как макроразведения в бульоне, является определение МПК для каждого препарата и одновременное тестирование 12 антибиотиков. Демонстрировать процедуру будет Курт Джуд, специалист по контролю качества моей лаборатории, работающий за лабораторным столом.

Подготовьтесь к данной процедуре, промаркировав чашку с кровяным агаром, три чашки с семи-H 10 средой Middlebrooks, пробирку со стеклянными шариками с физраствором и твином, а также микротитрационную пластину, указав имя пациента и идентификационный номер образца. Кроме того, пометьте чашку с кровяным агаром и чашки с средой семь-H 10 как «контроль чистоты». Одну из чашек с средой семь-H 10 пометьте как «подсчет колоний 1:1», а другую — как «подсчет колоний 1:50».

Затем поместите лоток в передаточный шлюз. Далее подготовьтесь к работе в лаборатории третьего уровня биобезопасности (BSL 3), надев халат с закрытым передним полотном, шапочку, перчатки, бахилы и респиратор. В данном случае используется респиратор PAPR.

Затем извлеките лоток из передаточного окна. Далее, в помещении уровня BSL-3, продезинфицируйте рабочую поверхность бокса биологической безопасности. Затем поместите внутрь бокса бумажное полотенце, пропитанное дезинфицирующим средством, примерно в шести дюймах от панели вентиляционной решетки рядом с бумажным полотенцем.

Подготовьте инокуляционные петли, дозаторы с наконечниками, подходящий контейнер для утилизации отходов, нефи, ТЕР и вортекс. После подготовки вытяжного шкафа поместите микроорганизм на бумажное полотенце вместе со штативом, содержащим стандарт МакФарланда 0,5, бульон 7H9 с OADC и пробирку с солевой гранулой. Данная процедура выполняется из твердой питательной среды.

Подготовьте инокулят из культуры на твердой питательной среде, полученной из образца пациента. С помощью стерильной петли соберите колонии и перенесите их в пробирку с стеклянными шариками, содержащую раствор Tween в физиологическом растворе. Перемешайте суспензию на вортексе в течение 30–60 секунд.

Визуально оцените образец, сравнив его со стандартом МакФарланда. Количество перенесенного материала должно быть равно или превышать значение стандарта. Если это не так, добавьте больше бактериального образца и снова перемешайте на вортексе.

После достижения соответствия стандарту МакФарланда дайте инокуляту отстояться в течение 15 минут, чтобы более крупные скопления бактерий осели. Затем используйте nefi TER для измерения плотности взвешенных бактерий до нулевого значения. The nephi ter.

Сначала поместите в нефелометр пробирку с контрольным раствором физиологического раствора. Нажмите кнопку калибровки, чтобы обнулить прибор, затем поместите в нефелометр стандарт МакФарланда 0,5 и снова нажмите кнопку калибровки. После калибровки прибора извлеките стандарт МакФарланда и вставьте инокулят.

Показатель инокулята должен соответствовать показателю стандарта Макфарланда. Если значение слишком низкое, извлеките пробирку и перенесите с чашки большее количество бактерий. Затем перемешайте образец на вортексе и проведите измерение повторно.

Если показатель слишком высок, добавьте в пробирку физраствор с твином и перемешайте на вортексе. Затем снова измерьте образец. Продолжайте корректировать инокулят до тех пор, пока концентрация бактерий не будет соответствовать стандарту МакФарланда.

Затем с помощью дозатора на 200 мкл и длинного наконечника с фильтром удалите 100 мкл инокулята из верхней трети пробирки. Чтобы избежать попадания в инокулят осадка, скопившегося на дне бульона Middlebrook 7H9, осторожно перемешайте инокулированный бульон на вортексе в течение 20 секунд перед высевом. Начните с извлечения микропланшета из заводской упаковки. Если осушитель стал синим или если фольгированная упаковка повреждена, не используйте этот планшет.

В лунках планшета уже находятся 12 тестируемых антимикробных препаратов, включая наиболее эффективные препараты первого ряда и препараты второго ряда. Осторожно перелейте инокулят в бульоне H nine в пробирку, стараясь не создавать аэрозолей. Затем поместите микропланшет этикеткой наружу, как показано здесь, и с помощью 12-канального дозатора добавьте по 100 µL инокулята в каждую лунку.

Далее подготовьте планшеты для подсчета колоний. Сначала подготовьте планшет без разведения, перенеся одну микролитровую петлю образца из лунки положительного контроля на планшет 7H 10 с маркировкой «один к одному». Затем с помощью петли проведите посев на планшет, как показано здесь.

Затем, для приготовления разведения 1:50, перенесите пробу с помощью петли объемом 1 µL из лунки с положительным контролем и перемешайте её в пробирке, содержащей 50 µL воды. Нанесите 1 µL этого разведения на планшет с пометкой 1:50. Посейте пластины для проверки чистоты, пипетировав 50 µL инокулята из бульона на соответствующим образом маркированные plates с кровяным агаром и plates 7 H 10, и проведите посев штрихом для выделения чистой культуры.

Затем накройте инокулированную пробирку TRTH другой пробиркой TRTH и осторожно поместите их в контейнер для утилизации. Заклейте микропланшет адгезивной sealing-пленкой. Затем, используя белую подложку, плотно прижмите каждую лунку, чтобы обеспечить герметичное закрытие, следя за отсутствием складок.

Продезинфицируйте микропланшет, протерев его бумажным полотенцем, смоченным в туберкулоцидном дезинфицирующем средстве. Затем поместите микропланшет в пластиковый пакет и закройте его с помощью термосварки. В завершение продезинфицируйте все материалы, включая наконечники, фильтр-вортекс, планшеты и пробирки, протерев их туберкулоцидным дезинфицирующим средством.

После этого используется профессиональный спрей, когда прошло достаточное время для обеспечения дезинфекции. Время воздействия спрея составляет 15 минут. Чашки фиксируют скотчем, помещают в пластиковые пакеты, а запечатанные материалы извлекают из бокса биологической безопасности и помещают в передаточное окно.

На этом этапе пакет для красных отходов закрывают и запечатывают завязкой, после чего снимают халат, бахилы и перчатки. Перейдя в предкамеру и вымыв руки, снимите респиратор, продезинфицируйте его и уберите на хранение; повторно вымойте руки, наденьте чистый халат и покиньте зону BSL-3. Затем контейнер с отходами подвергают автоклавированию.

После этого инкубируйте микропланшет и семь планшетов H 10 и blood auger в перевернутом положении в инкубаторе при температуре 35–37 °C с содержанием 5–10% CO2 в лаборатории уровня BSL-2. Это допустимо, так как планшет плотно запечатан и помещен в пластиковый пакет. Время генерации Mycobacterium tuberculosis составляет примерно 12–24 часа, поэтому до появления видимого роста в виде образования клеточного осадка на дне контрольной лунки пройдет не менее недели. На 10-й день проведите ручное считывание в зеркальном боксе, поместив запечатанный микропланшет AST на платформу бокса.

Используйте настольную лампу, чтобы облегчить визуализацию роста, и при необходимости отрегулируйте её положение для достижения наилучшего контраста. Проверьте лунки контроля роста, в данном случае H 11 и H 12, глядя в зеркало. При наличии роста содержимое лунки будет выглядеть мутным или с осадком, как показано здесь.

Если рост отсутствует, как показано в данном примере, содержимое лунки будет прозрачным. В этом случае верните планшет в инкубатор и продолжайте инкубацию в течение периода до 21 дня. Для каждого условия сравните рост с контролем.

Таким образом, для каждой записи о препарате определяется первое разведение, при котором рост отсутствует. Это минимальная ингибирующая концентрация или МИК данного препарата. Для анализа результатов с помощью автоматического планшетного ридера, такого как Vision, начните с открытия программного обеспечения MycoTB AST plate и входа в систему. Установите герметичный планшет штрих-кодом наружу, как показано здесь. На экране компьютера рост выглядит как помутнение или осадок клеток на дне лунки.

Сначала проверьте контроли роста. Как и прежде. Если рост отсутствует, верните чашку обратно в инкубатор на срок до 21 дня.

Если результат положительный, зафиксируйте его, коснувшись на экране первой лунки для каждого препарата, в которой не наблюдается роста. В некоторых случаях бактерии, осадок или препараты выпадают в осадок на дно лунки. Это явление, известное как «шлейф» (trailing), характеризуется наличием нескольких лунок с осадком одинакового размера и фактически не считается положительным ростом.

Затем семь чашек с H 10 и кровяным агаром исследуют для определения концентрации бактерий и оценки чистоты культуры. На чашке с кровяным агаром через 48 часов роста быть не должно. Рост на чашке с кровяным агаром указывает на контаминацию быстрорастущими бактериями.

При наличии роста микротитрационный тест необходимо повторить. На пластине для проверки чистоты H 10 должен наблюдаться рост одного организма. Штамм EM tuberculosis должен иметь бежевый цвет, быть морщинистым и шероховатым. В случае контаминации микротитрационный тест следует повторить, используя чистую культуру.

Для оценки концентрации бактерий подсчитайте количество колоний на седьмой чашке H 10. Затем, используя таблицу в прилагаемом письменном документе, рассчитайте число колоний. Mycobacterium tuberculosis была выращена из образца пациента, и устойчивость к антибиотикам оценивалась, как описано в данном видео; на представленной здесь чашке находятся 12 различных препаратов в возрастающих концентрациях, где самые высокие концентрации расположены сверху, а самые низкие — снизу.

Минимальная подавляющая концентрация, или МПК препарата, определялась как самая низкая концентрация препарата, при которой не наблюдалось роста; она обведена кружком на представленном здесь изображении с использованием стандартных пороговых значений, установленных Институтом клинических и лабораторных стандартов (CLSI). Представленные данные свидетельствуют о том, что данный штамм туберкулеза будет резистентен к исониазиду и рифампицину. В условиях in vitro высокие значения МПК, выявленные для ряда других препаратов, включая олемицин, моксифлоксацин, стрептомицин и рифабутин, указывают на устойчивость штамма туберкулеза EM к этим агентам.

Результаты определения МПК должны использоваться специалистом по инфекционным заболеваниям, имеющим опыт лечения туберкулеза, для разработки индивидуального плана лечения. После освоения данной методики подготовка одного изолята занимает около 40 минут. При выполнении этой процедуры важно помнить, что данный патоген передается воздушно-капельным путем и может приводить к образованию аэрозолей. После просмотра этого видео у вас должно сложиться четкое представление о том, как проводить тестирование чувствительности mycobacterium tuberculosis к антимикробным препаратам методом микроразведений в бульоне. Не забывайте, что работа с mycobacterium tuberculosis может быть крайне опасной, и следует всегда соблюдать необходимые меры предосторожности, такие как использование средств защиты органов дыхания.