Сообщение Microfabricated-Array-детекторы (ПЗРК): Подход к изолят механических сил

Здравствуйте, меня зовут Нейтан Сня Деки, сегодня со мной Уэс Лиган, Робби Десаи и Майк Янг. Мы представляем лабораторию Криса Чена здесь, в Пенсильванском университете. В этом видео мы представим наш подход к измерению сил клеточного притяжения с использованием микроизготовленного массива столбиков.

Силы тяги возникают в результате взаимодействия миозина и актина и играют важную роль в нашей физиологии. В процессе развития они позволяют клеткам перемещаться из одного места в другое для формирования первичных структур тканей. Также они способствуют процессу заживления, так как необходимы для закрытия ран, а также для миграции и перемещения лейкоцитов по организму.

Однако, к сожалению, те же самые силы могут нанести вред нашему здоровью в случае метастазирования рака или роста сосудов в сторону опухоли. Поэтому существует очень мало методов, позволяющих количественно измерить эти силы тяжения, особенно на микро- и наномасштабе отдельных клеток. Большинство распространенных методов изучения клеток in vitro предполагают использование чашек с стеклянным дном или полистироловых чашек, но это очень жесткие субстраты, которые не позволяют физически измерить силы тяжения и деформации, вызываемые клеткой.

Таким образом, без какого-либо физического считывания было очень трудно понять основные механизмы возникновения сил тяги. В лаборатории Криса Чена мы используем метод, который позволяет преодолеть эти ограничения. Наш метод основан на вертикальном массиве гибких консолей, жесткость и масштаб которых таковы, что отдельные клетки распределяются по нескольким консолям и в процессе этого вызывают их отклонение.

Наиболее часто используемые нами размеры: цилиндрические стойки диаметром 3 микрон и высотой 10 микрон, расположенные прямоугольным массивом с межосевым расстоянием 9 микрон. Однако эти параметры могут быть изменены для адаптации под различные клеточные исследования. Мы начинаем с жесткого кремниевого мастер-шаблона, который вы видите здесь, а затем переносим эти структуры на гибкие консоли из PDMS, которые представлены здесь.

С помощью этого метода мы можем измерять отклонения отдельных консолей под микроскопом и определять клеточные силы тяги с амплитудой и направлением, необходимыми для создания таких отклонений. Мы преобразовали эти подложки в М-платформы (M pads) для детекторов с массивом микростолбиков, и в этом видео мы покажем вам, как изготовить М-платформы, начиная с создания силиконовой мастер-формы и заканчивая репликацией из PDMS и последующим расчетом модуляции и клеточной сократимости. Здравствуйте, мы находимся в чистом помещении нашей лаборатории.

Это помещение с контролируемой чистотой и защитой от света, где мы изготавливаем стойки из SU-8, которые будут служить кремниевой матрицей. Сначала мы возьмем кремниевую пластину и нанесем на нее фоторезист SU-8; SU-8 является негативным светочувствительным резистом. Таким образом, при освещении через фотошаблон свет сформирует рисунок микростоек, создавая трехмерную структуру, которая и станет стойками из SU-8, используемыми затем для отливки из PDMS.

После завершения всей обработки пластина будет выглядеть следующим образом: на ней уже сформированы микростолбики и микропостовые структуры. Для изготовления мастер-форм мы начинаем с чистой кремниевой пластины, которую предварительно очищали озоном в течение семи минут и дегидратировали в течение 30 минут при 120 °C. Теперь мы нанесем на нее SU-8 2002 методом центрифугирования, чтобы создать очень тонкий базовый слой для столбиков.

Поскольку мы будем наносить SU-8, я надену противогаз. Поместите пластину в этот держатель, удалите с нее всю пыль, установите на центрифугу и убедитесь, что она центрирована. Затем мы нанесем на нее SU-8 2002. После этого запустим центрифугу. Затем мы поместим пластины на нагревательную плитку для мягкого излечивания.

После этого выдерживают в течение одной минуты. Затем образец переносят на нагревательную плитку при температуре 95 °C и выдерживают в течение двух минут.

По завершении мы перенесем образец в установку масочного выравнивателя для проведения сплошного засвечивания. Итак, мы только что нанесли SU eight, первый слой SU eight на эту пластину, и теперь нам необходимо подвергнуть всю пластину сплошному засвечиванию для создания первого базового слоя микростолбиков. Для этого нам потребуется доза облучения 70 millijoules.

Теперь нам необходимо измерить фактическую интенсивность света в нашем установке для совмещения масок. Для этого мы помещаем измеритель в установку для совмещения масок. Затем мы подвергаем его воздействию света.

Здесь используется УФ-излучение. Мы устанавливаем кремниевую пластину в установку для совмещения масок. В данном случае маска не используется, чтобы обеспечить экспозицию всей поверхности пленки.

Установите затвор, установите время экспозиции одну минуту и приступите к экспонированию. По истечении одной минуты система завершит работу, и мы сможем извлечь пластину. Теперь необходимо провести запекание после экспозиции.

Мы только что произвели экспонирование этой пластины, и теперь мы будем воздействовать на нее теплом, чтобы вызвать реакцию сшивания для этого первого слоя SU-8. Мы помещаем пластину на нагревательный стол с температурой 65 °C на одну минуту, а затем переносим на нагревательный стол с температурой 95 °C на две минуты. После завершения этого двухминутного процесса мы выключаем нагревательный стол и даем пластине остыть до комнатной температуры, что занимает около 30 минут.

Таким образом, мы нанесли второй слой SU-8 на эту подложку. Теперь нам необходимо произвести экспозицию через фотошаблон. В этот раз мы будем использовать УФ-фильтр, чтобы отсечь глубокий ультрафиолетовый свет.

Это оптическое стекло Hoya, которое можно приобрести, но на данном этапе нам снова необходимо измерить интенсивность. Для этого мы воспользуемся люксметром, установив фильтр сверху, чтобы измерить интенсивность отфильтрованного света. После этого мы установим маску в установку для совмещения масок.

Этот переключатель создает вакуум, который фиксирует маску на месте. Затем мы поместим ее в установку для совмещения масок. После этого мы установим сверху фильтр и загрузим пластину.

Чтобы обеспечить хороший контакт, мы поднимаем подложку до соприкосновения, после чего начинаем экспонирование. По завершении экспонирования мы извлекаем пластину из масочного выравнивателя. Таким образом, у нас появились селективно экспонированные области. Теперь мы перенесем пластину на нагревательные плиты в печь для проведения запекания после экспонирования.

Итак, мы только что завершили финальный запекательный этап после экспонирования, и теперь мы приступим к проявлению этой пластины, чтобы получить трехмерные структуры. Мы промоем пластину и проявим ее в PGMEA, который удалит неэкспонированный SU-8. Для начала мы поместим пластину в чашку с PGMEA на две минуты при умеренном перемешивании.

Я оставлю это на две минуты. Затем мы перенесем образец во вторую чашку с P-G-M-E-A. Это позволит удалить насыщенный P-G-M-E-A с SU eight.

Через 10 секунд мы перенесем образец в изопропанол (IPA). Это позволит смыть PGMEA. Мы оставим его здесь на 20 секунд, также подвергая легкому перемешиванию.

Теперь перед нами отдельно стоящие структуры стоиков. Мы поместим их в гексан, который обладает низким поверхностным натяжением. Мы будем промывать их в течение пяти секунд сначала в одной, а затем в двух порциях гексана, после чего приступим к их высушиванию с помощью потока воздуха.

Итак, мы завершили проявление пластины, и теперь мы поместим ее на нагревательную поверхность, медленно поднимая температуру до 150 °C. При более высокой температуре происходит дальнейшая сшивка SU-8, что делает структуру более жесткой; пластина остается на нагревательной поверхности на ночь. Обычно это занимает от 14 до 20 часов, после чего мы выключаем нагревательную поверхность и даем пластине снова остыть до комнатной температуры.

Теперь нам необходимо разрезать эту пластину на фрагменты меньшего размера. По сути, мы хотим разрезать кремниевую пластину, чтобы создать небольшой кристалл, содержащий только этот внутренний рисунок. В итоге получится структура, подобная той, что представлена здесь, где будет использоваться эпоксидный клей.

Затем мы приклеим этот кристалл к предметному стеклу следующим образом. Это обеспечит структурную поддержку. Разрезка пластины — это своего рода искусство, но основной метод заключается в использовании алмазного резака, начиная с одного края.

И благодаря кристаллическим плоскостям достаточно сделать небольшой надрез. Это создает трещину, по которой затем можно аккуратно постучать этим инструментом. Мы можем отделить этот фрагмент и продолжить делать надрезы здесь, пока не получим такую небольшую структуру. После этого кремниевый чип быстро помещают на стекло и закрепляют на месте. Затем следует дать соединению застыть.

Таким образом, по завершении работы у вас будет устройство, подобное этому. Мы закрепили кремниевую матрицу на этом предметном стекле, и теперь мы нанесем покрытие из фторсилана, которое в дальнейшем поможет отделить эту структуру от PDMS. Теперь мы поместим чип в этот эксикатор, а затем добавим несколько капель трихлорсилана в эксикатор.

Мы выполняем эту процедуру внутри вытяжного шкафа, так как в результате образуется побочный продукт в виде газообразного хлороводорода, который весьма агрессивен. Закройте крышку, подключите систему к вакуумному насосу, после чего оставьте образец под вакуумом для осаждения в течение ночи, чтобы получить равномерный слой покрытия по всей кремниевой пластине. Здравствуйте, я Уэсли Лиган.

Я аспирант в лаборатории Кристофера Чена. К этому моменту Нейт уже показал вам, как создать силиконовую мастер-форму для наших подложек ED. Однако прежде чем мы сможем использовать этот инструмент для измерения сократимости клеток, необходимо воспроизвести жесткие фотоструктуры с помощью эластомерного силиконового полимера.

Наша первая задача — создать негативный шаблон силиконовой мастер-формы, которую мы изготовили ранее. Для этого мы используем силиконовый эластомер, называемый PDMS или полидиметилсилоксан. Теперь мы добавляем отвердитель в соотношении 1:10 к полимеру PDMS.

После взвешивания раствора необходимо тщательно перемешать полимер PDMS и сшивающий агент. Такое перемешивание неизбежно приводит к появлению большого количества пузырьков воздуха в растворе. Поэтому на данном этапе раствор необходимо накрыть и подвергнуть дегазации в вакуумном эксикаторе.

После того как из PDMS полностью удален воздух и все пузырьки поднялись на поверхность и лопнули, его можно извлечь из вакуумного эксикатора. Теперь эту смесь PDMS и сшивающего агента можно использовать для создания негативного шаблона нашего кремниевого мастера. Для этого мы берем форму из фольги и помещаем в ее центр закрепленный кремниевый мастер.

Затем мы осторожно наливаем раствор полимера DGAs в чашку поверх кремниевой пластины, стараясь предотвратить образование дополнительных пузырьков. Как правило, мы стремимся налить полимер слоем толщиной примерно в четверть дюйма. Видно, что в результате этого процесса в смесь неизбежно попадает несколько пузырьков воздуха.

Теперь оставим чашку примерно на 30 минут, чтобы пузырьки поднялись на поверхность и лопнули. Мы видим, что после отстаивания на поверхности PDMS все еще осталось несколько пузырьков воздуха. Поскольку они находятся на верхней поверхности, теперь мы можем использовать короткий поток азота, чтобы удалить все оставшиеся пузырьки.

Для полной сшивки раствора PDMS и CROSSLINKER и создания жесткого негативного шаблона нашего кремниевого мастер-образца мы подвергаем его термической обработке при 110 °C в течение 20 минут. Видно, что на поверхности кремниевой подложки имеется тонкий слой PDMS. Перед тем как разделить эти два слоя, необходимо сначала срезать данный слой.

Затем мы можем привить этот верхний слой и аккуратно отделить его от кремниевой подложки. На этом этапе можно перевернуть и очень медленно отделить негативную кремниевую подложку, негативную подложку из ПДМС, от силиконовой матрицы. Мы делаем это, придерживая один край и осторожно отслаивая подложку из ПДМС.

Вы можете видеть продвижение фронта по мере того, как подложка отслаивается от силиконовой матрицы. Теперь, когда мы создали негативный оттиск из PDMS по нашей силиконовой матрице, мы можем разрезать его на четыре отдельные негативные формы для изготовления окончательных подложек планшетов. На этом этапе важно не касаться верхней поверхности негативной подложки пинцетом или перчатками, чтобы избежать повреждения поверхности.

Таким образом, на данном этапе мы изготовили четыре отдельные негативные формы из силиконовой матрицы, состоящей из лунок диаметром 3 µm и глубиной 9 µm. Чтобы восстановить выпуклые поверхности консолей, мы можем снова выполнить литье в эти негативные формы, используя PDMS от PDI. Однако прежде чем приступить к этому, необходимо сделать негативные формы неадгезивными, покрыв их фторполимером.

Эту процедуру проводят в плазменной камере мощностью 100 Вт при полной мощности в течение одной минуты. После того как камера будет откачана и плазма снова будет включена, создастся ионное газовое поле, которое подвергнет воздействию поверхности PDMS верхний слой, делая его более адгезивным к молекулам фторированного Cy Lane. После извлечения негативных форм из вакуумного эксикатора можно увидеть, что в итоге получается массив лунок глубиной 3 мкм на 10 мкм в неадгезивном слое PDMS.

Для регенерации вертикальных консолей, которые мы используем для подложек mpad, необходимо снова произвести отливку, используя ту же смесь PDMS; в результате получится положительный свободностоящий массив эластомерных консолей, который идентично повторяет кремниевую мастер-форму, изготовленную нами ранее. Первым шагом в этой процедуре является перенос наших неадгезивных негативных форм на монтажное приспособление, созданное из полосок PDMS и предметного стекла микроскопа. Назначение этого приспособления станет понятно на следующем этапе.

На данном этапе можно нанести небольшую каплю той же смеси PDMS и отвердителя в соотношении 10:1, которая уже прошла дегазацию, на верхнюю поверхность каждой негативной формы. Требуется лишь небольшое количество PDMS, чтобы оно не растеклось за края негативных форм. На этом этапе.

Чтобы более равномерно распределить PDMS по верхней поверхности форм, можно взять одну из них пинцетом, перевернуть и привести в контакт с соседней формой, осторожно распределяя PDMS так, чтобы полностью покрыть всю подложку. На этом этапе следует быть очень аккуратным, чтобы не допустить появления новых пузырьков в верхнем слое раствора PDMS; затем процедуру повторяют с двумя другими лунками, двумя другими формами. Теперь, когда мы получили более однородное покрытие PDMS по всей верхней поверхности, данное приспособление можно поместить в вакуумный эксикатор для окончательного удаления пузырьков, которые могли остаться в пленке PDMS поверх негативных форм.

Этот процесс обычно занимает около 30 минут. Пока наши негативные формы подвергаются дегазации, мы можем очистить стеклянные подложки размером 22 на 22 миллиметра, которые станут окончательным местом крепления подушечек. Первым этапом этого процесса является удаление частиц пыли с помощью сжатого азота.

Мы подвергнем стеклянные покровные стекла воздействию газовой плазмы, что позволит очистить поверхность методом «золирования» и повысить ее адгезию к PDMS, который мы прикрепим на следующем этапе. После того как верхний слой PDMS будет подвергнут воздействию DGAs в течение примерно 30 минут, а стеклянные покровные стекла пройдут плазменную активацию, можно будет снять шаблон и привести верхнюю поверхность стеклянных покровных стекол, подвергшихся воздействию газовой плазмы, в контакт со слоем PDMS поверх негативных форм. Как правило, удобно сначала прижать к PDMS один край стеклянного покровного стекла, а затем позволить остальной части стекла опуститься в SH так, чтобы PDMS распределился в виде сплошного слоя.

Это помогает уменьшить количество пузырьков воздуха, попавших в пленку из PDMS. На данном этапе можно осторожно нажать пинцетом на верхнюю поверхность предметного стекла, чтобы вытеснить излишки PDMS, а также плотно прижать предметное стекло к перекрестию из PDMS в центре шаблона. Это предотвратит смещение предметного стекла во время отверждения PDMS.

Мы повторяем эти действия для остальных подложек. На этом этапе весь шаблон можно перенести в печь и подвергнуть обжигу при 110 °C в течение 22 часов. После охлаждения всей сборки до комнатной температуры мы извлекаем подложки, переворачиваем их и осторожно отделяем негативную форму от покровного стекла.

Важно выполнять это медленно и равномерно, чтобы избежать раздавливания столбиков или их отрыва от стеклянной подложки. Мы видим, что после снятия негативного шаблона остается массив консолей, который точно повторяет кремниевую матрицу, но теперь они изготовлены из гибкого эластомера PDMS. Итак, на данном этапе мы подробно разобрали процесс создания кремниевой матрицы для наших подложек Emad.

Затем мы использовали процесс репликационного формования для создания точной копии с помощью эластомерного полимера PDMS, чтобы консоли стали гибкими, что позволит клетке распластываться, сокращаться и в процессе этого отклонять консоли. На данном этапе наши подложки готовы к обработке для клеточного культивирования. Теперь, когда мы увидели, как изготавливать и реплицировать формы для создания EDS, мы выполним еще несколько шагов, чтобы сделать EDS функциональными для культивирования клеток и последующего анализа сил тяги.

Но прежде чем приступить к этому, необходимо выполнить три действия. Во-первых, нужно сделать кончики столбиков адгезивными по отношению к клеткам. Во-вторых, необходимо флуоресцентно пометить PDMS, чтобы облегчить визуализацию и анализ отклонения столбиков.

И в-третьих, нам необходимо сделать боковые стенки и основание столбиков неадгезивными для клеток, чтобы силы тяги воздействовали только на вершины столбиков. В последующие минуты мы увидим, как эти этапы выполняются с помощью стратегии микроконтактной печати. Но сначала следующим шагом будет удаление излишков PDMS с поверхности.

Как я уже упоминал, на первом этапе необходимо взять подложку EDS, способ изготовления и обрезки которой только что продемонстрировал Уэст. Излишки PDMS, образовавшиеся в результате отверждения покровного стекла на негативном шаблоне, удаляют с помощью острого лезвия бритвы. Для этого лезвие приставляют вертикально к подложке у края столбиков и затем соскабливают лишний материал.

Вы можете придерживать покровное стекло одним пальцем, чтобы оно не смещалось. В итоге мы получаем подложку MPA, очищенную от мусора и готовую к дальнейшей работе. На следующем этапе необходимо выполнить микроконтактную печать на MPA, чтобы сделать вершины столбиков адгезивными.

Для этого нам сначала необходимо изготовить штампы; этот процесс очень прост. Мы просто смешиваем PDMS, используя соотношение 1:30 вместо 10:1. Полученную смесь заливают в чашку Петри так, чтобы высота слоя PDMS составляла примерно 1 см.

Дайте раствору дегазироваться. То есть дождитесь, пока пузырьки поднимутся на поверхность PDMS, и проведите реакцию сшивания в печи при 60 °C в течение одного часа. После извлечения чашки из печи и ее охлаждения можно приступать к вырезанию штампов. Снова используя то же лезвие бритвы, просто вырезайте, нажимая вертикально вниз по PDMS, пока не достигнете дна чашки Петри.

Теперь следует обратить внимание на ориентацию штампа. Поверхностью штампа является та сторона PDMS, которая прилипала к дну чашки Петри, чтобы она оставалась плоской. Таким образом, в этом вырезанном большом квадрате PDMS поверхность штампа сейчас обращена вверх.

Теперь этот штамп гораздо больше, чем подушечки M, поэтому я обрежу его до размера одной подушечки M с помощью лезвия. Поскольку на глаз определить правильную ориентацию штампа очень сложно, я сделаю небольшую зазубрину на той стороне, которая будет задней (не лицевой), вот так. После этого я могу отделить штамп от большой пластины. Теперь у меня есть штамп A-P-D-M-S для следующего этапа.

Необходимо очистить штампы из PDMS. Поскольку при вырезании штампов на них вполне могла осесть пыль из воздуха, мы помещаем нужное количество штампов из PDMS в чашку для кристаллизации и заполняем её 100% ethanol.

Добавьте достаточное количество этанола, чтобы покрыть поверхность штампов; точный объем добавляемого этанола не имеет значения. Затем поместите диск для кристаллизации в стакан и подвергните штампы воздействию ультразвука в течение пяти минут. По истечении пяти минут стерилизация штампов будет завершена, и оставшаяся часть процесса микроконтактной печати — функционализация M-подушечек — будет проводиться в стерильном ламинарном шкафу для культивирования тканей.

Теперь мы находимся в ламинарном шкафу для культуры тканей, где мы можем завершить стерилизацию штампов. Для этого мы переносим штампы из чашки для кристаллизации, погружаем их в чашку с этанолом для удаления остатков загрязнений и, наконец, погружаем в чашку с водой, чтобы смыть этанол. Затем с помощью потока азота мы высушиваем штампы до полного исчезновения видимых капель.

Следующим шагом необходимо нанести на штампы белковый раствор. В качестве белкового раствора мы используем фибрин в деионизированной воде в концентрации 50 µg/mL. Просто наберите часть белкового раствора в пипетку и нанесите капли раствора на рабочую поверхность штампа.

Для этого нанесите маленькие капли по краю поверхности штампа. Сначала повторите эту процедуру для всех используемых штампов; это следует сделать заранее. Следующим шагом после нанесения капель по краям всех штампов будет соединение этих капель и заполнение поверхности штампа белковым раствором.

Это делается потому, что белковый раствор в каплях и под ними делает поверхность штампа гидрофильной, что облегчает распределение белка внеклеточного матрикса. Повторите эту процедуру для всех используемых штампов. Теперь, когда белковый раствор распределен по поверхности штампов, последним этапом их «начернивания» является обеспечение покрытия краев. Для этого просто наклоните пипетку и проведите ею по поверхности штампа так, чтобы она соприкасалась одновременно с углом PDMS-штампа и белковым раствором.

Повторите эту процедуру для всех кромок всех штампов, которые вы обрабатываете чернилами. После завершения нанесения белков на штампы, поместите их в ламинарный шкаф для культур тканей на один час, чтобы обеспечить полное поглощение белка поверхностью штампа. По истечении одного часа, когда белки адсорбировались на поверхности штампов, промойте их водой и просушите потоком азота.

Для этого возьмите стерильную воду и налейте ее в чашку со штампами. Будьте осторожны, чтобы не лить воду непосредственно на рабочую поверхность штампа; при необходимости можно использовать пипетку. Точный объем воды не имеет значения, главное, чтобы уровень воды был выше уровня белкового раствора.

После этого с помощью стерильного пинцета возьмите один штамп, окуните его в новую чашку с водой и аккуратно просушите потоком азота. Вы поймете, что штамп высох, когда на нем перестанут быть видны капли белкового раствора. Повторите эту процедуру для всех обрабатываемых штампов по одному.

Теперь, когда мы промокнули штампы досуха, пришло время активировать подложки mpad путем обработки их УФ-озоном. Я снимаю крышку с чашки Петри. Поскольку полистирол поглощает УФ-излучение, я помещаю чашку в установку для УФ-озоновой обработки, закрываю выдвижной ящик, устанавливаю время на семь минут и запускаю процесс.

Теперь мы снова находимся в ламинарном шкафу, и пришло время прижать штампы к подложкам mpad, которые только что были обработаны УФ-озоном. Для этого поднимите промытые и высушенные штампы с помощью пинцета. Штампы можно держать за края, но не касайтесь их рабочей поверхности.

Необходимо отрегулировать положение штампа в пинцете так, чтобы белковая сторона была доступна. Затем переверните пинцет, учитывая, что белковая сторона направлена вниз, и медленно приведите штамп в контакт с eds. Штампы от 1 до 30 довольно липкие, поэтому для извлечения штампа из пинцета может потребоваться вторая пара пинцетов.

Штамп можно опустить с высоты от примерно двух миллиметров до примерно восьми миллиметров на emeds. Затем наклоните планшет с emeds и осторожно нажмите пинцетом, чтобы обеспечить контакт между штампом и eds. О контакте можно будет узнать одним из двух способов.

Первый способ заключается в том, чтобы осмотреть поверхность ED через боковую сторону штампа. Это может быть трудно разглядеть на видео, но при непосредственном осмотре я четко вижу, что штамп контактирует с поверхностью. Второй способ обеспечить контакт — вынести чашку Петри из ламинарного шкафа с закрытой крышкой и осмотреть ее под инвертированным микроскопом.

Визуализируя интерференционные картины с помощью микроскопа, вы сможете определить, вступил ли штамп в контакт с подложкой. После того как контакт будет установлен, штампу достаточно оставаться в контакте с этой подложкой в течение нескольких секунд. Таким образом, теперь можно removing штамп.

Для этого отогните края (eds) одной парой пинцетов и одним плавным движением снимите штамп. Обязательно отслеживайте, какие края были проштампованы и какие штампы вы уже использовали ранее. Повторите эту процедуру один раз для каждого EMPA для каждого субстрата, который вы планируете использовать.

Теперь, когда мы изготовили оттиски EMPA, следующим шагом будет их стерилизация с последующей инкубацией в липофильном красителе, называемом dye eye. Dye eye представляет собой липофильную молекулу с флуоресцентной меткой, которая диффундирует в PDMS в течение определенного времени, что позволяет нам визуализировать отклонения столбиков под микроскопом. Для этого я буду брать каждый отдельный субстрат empa по очереди и погружать его в 100% ethanol, 70% ethanol, DI water, DI water, DI water, DI water.

И наконец, раствор dii в концентрации five µg/mL. Раствор DII обладает флуоресценцией, поэтому, чтобы минимизировать его воздействие внешнего света и предотвратить фотовыгорание, мы накрываем планшеты алюминиевой фольгой на время инкубации в ламинарном шкафу для культивирования тканей в течение одного часа. После того как EM-пэды выдержали один час в растворе DAI, мы можем снять алюминиевую фольгу и промыть их от раствора DAI.

Мы промываем их, трижды последовательно погружая в стерильную воду, и в завершение погружаем в 0,2% раствор onic F1 27. Концентрация составляет 0,2% по массе к объему. На всех этапах погружения важно минимизировать время воздействия воздуха на EM-платформы. Это необходимо для предотвращения повреждения подложек ED и, в частности, для того чтобы два стойки не слиплись друг с другом.

0,2% раствор F1 27 представляет собой триблок-сополимер, состоящий из гидрофильных и гидрофобных доменов. Известно, что гидрофильный домен препятствует абсорбции белков и, следовательно, адгезии клеток, в то время как гидрофобный домен связывается с гидрофобным PDMS. Таким образом, при замачивании PDMS в растворе F1 27, F1 27 связывается с PDMS и предотвращает адгезию клеток.

После одного часа инкубации в хроническом F1 27 в чашке Петри, накрытой алюминиевой фольгой, мы можем промыть F1 27 путем последовательного погружения в стерильную воду, стерильную воду и PBS. После погружения в PBS и промывки продукта F1 27 мы можем погрузить субстраты eds в выбранный раствор для культивирования клеток. Раствор для культивирования клеток, в который я только что погрузил EMPA, может содержать сыворотку и/или другие факторы роста и/или добавки, такие как пенициллин и стрептомицин.

Все эти ингредиенты полностью совместимы с обработкой EMPA. Следующим шагом после погружения eds в раствор для культивирования клеток является высев выбранных клеток на eds. В рамках данной конкретной экспериментальной установки я произведу высев эндотелиальных клеток легочной аорты быка в три разные чашки.

Я использую три разные чашки, поскольку две из них я обработаю известными ингибиторами тактильности, чтобы подавить отклонение столбиков; это позволит нам провести соответствующий анализ позже. Чтобы засеять клетки, я просто беру суспензию клеток, набираю в пипетку подходящий объем и по каплям вношу в каждую чашку. Я добавляю достаточное количество клеток, чтобы при проведении анализа для измерения сил тяги клетки располагались на подложке поодиночке.

Количество добавляемых клеток зависит от площади посева, а также от скорости роста конкретных линий клеток. Обычно мы высеваем от 1500 до 5 000 клеток на квадратный сантиметр субстрата. После завершения посева или добавления клеточной суспензии по каплям, аккуратно покачайте чашку с культурой несколько раз в противоположных направлениях по взаимно перпендикулярным осям, чтобы равномерно распределить клеточную суспензию по поверхности чашки.

Повторите этот процесс для всех используемых подложек. Сразу после посева клеток поместите их в инкубатор при температуре 37 °C с соответствующим уровнем содержания углекислого газа для буферизации pH и питательной среды для культур клеток. Примерно через два часа после посева клеток рекомендуется промыть их, перенеся подложки из одной чашки с средой в новую чашку с такой же питательной средой для культур клеток.

Причиной данного промывания является то, что большинство клеток к двум часам уже начнут распластываться и достигнут почти своей конечной площади распластывания. Промывая субстраты с клетками, вы удаляете все свободно плавающие клетки из культуральной среды. Таким образом, в конечном анализе сил тяжения будут отображаться только те клетки, которые прикрепились к EDS и начали процесс распластывания.

Одним из анализов, которые можно провести с клетками, культивируемыми на MPA, является таймлапс-визуализация для количественного изучения динамики клеточной сократимости. В частности, интерес представляет динамика сократимости клеток в ответ на воздействие растворимых факторов. Известно, что растворимые факторы, такие как биологические и синтетические соединения, могут усиливать, ослаблять или оказывать неизвестное влияние на клеточную сократимость.

Для этого эксперимента с живыми клетками мы будем использовать данный инвертированный эпифлуоресцентный микроскоп. На предметном столике микроскопа установлен небольшой инкубационный бокс, подключенный к терморегулятору для поддержания температуры 37 °C и содержания 5% CO2. Визуализация будет проводиться при большом увеличении с использованием Plan APO объектива 60x.

Теперь мы подготовим подложку с имплантатом для визуализации. Объектив с увеличением 60x, который мы используем для съемки, имеет рабочее расстояние 200 микрон, что значительно меньше толщины чашки для культивирования тканей, в которой мы ранее высеяли клетки. Следовательно, мы не можем проводить визуализацию клеток на имплантатах непосредственно в чашке для культивирования.

Чтобы решить эту проблему, мы используем чашки с стеклянным дном. Теперь я перенесу субстрат в чашку со стеклянным дном в перевернутом виде, чтобы клетки и кончики столбиков находились на границе со стеклянным дном чашки. Таким образом, при размещении на микроскопе рабочее расстояние между клетками и объективом составит менее 200 мкм.

Теперь мы готовы поместить образец под микроскоп для получения изображений. Сейчас я открою камеру инкубатора для живых клеток, помещу внутрь образец и закрою крышку камеры инкубатора. После этого я просканирую субстрат в поиске подходящей клетки.

Для получения изображений наиболее эффективным способом будет использование фазового объектива 10x, что позволит охватить более широкое поле зрения субстрата и быстрее найти клетку. Моим критерием выбора подходящей клетки является поиск одиночной клетки.

Клетка не должна касаться соседних клеток, а по размеру она должна быть примерно средней по сравнению со всеми остальными клетками на подложке; я нашел подходящую клетку для наблюдения. Следующим шагом я переключу объектив на 60 x, чтобы рассмотреть клетку при большом увеличении. Для этого необходимо расфокусировать объектив, чтобы он не задел предметный столик во время поворота.

Во время вращения револьвера откройте камеру и частично поверните объектив 60x. Объектив 60x является иммерсионным, поэтому на линзу объектива необходимо нанести каплю иммерсионного масла. Теперь завершите вращение револьвера, чтобы привести объектив 60x в рабочее положение. Закройте камеру инкубатора и снова настройте фокус объектива, чтобы клетка снова стала четкой.

После точной настройки положения и фокусировки клетки я переключусь на ПЗС-камеру, чтобы предварительно просмотреть изображение клетки на экране компьютера, а затем начну таймлапс-съемку. В данном эксперименте я буду собирать как фазово-контрастные, так и флуоресцентные изображения с интервалом в одну минуту. Таймлапс-съемка началась; я оставлю её работать на 10 минут или до получения 10 кадров, после чего добавлю сыворотку. Прошло 10 минут. Теперь я открою камеру и добавлю в чашку сыворотку, чтобы стимулировать сократимость клетки.

Таймер все еще работает, поэтому мне нужно действовать быстро. Теперь мы продолжим визуализацию клетки в течение 30 минут, чтобы проследить за любыми изменениями сократимости. После завершения таймлапс-съемки полученные изображения можно объединить в последовательность для создания фильма. Вот два фильма с фазово-контрастными и флуоресцентными изображениями.

Слева представлено фазово-контрастное видео почти прозрачной клетки, обведенной черным контуром. Клетка распределена по вершинам 20 столбиков, которые представляют собой круглые структуры, расположенные в виде прямоугольной решетки. Справа показано флуоресцентное видео той же клетки, при этом видны только столбики.

При воспроизведении этих видеороликов вы увидите, что стойки, прикрепленные к клетке, изначально слабые, отклонены и очень мало отклоняются от прямоугольной решетки. Ближе к середине видео я добавил сыворотку в среду. Сыворотка стимулирует клетку к увеличению сократимости.

По мере того как клетка прикладывает более сильные тяговые усилия к расположенным под ней столбикам, столбики по периметру клетки начинают отклоняться внутрь. На флуоресцентном видео теперь видно, что столбики значительно отклоняются от своих исходных позиций в прямоугольной решетке. Как я опишу далее, смещение этих столбиков на изображениях может быть использовано для анализа тяговых усилий данной клетки.

Ранее мы рассмотрели процесс изготовления подложек mpad и способы их функционализации для культивирования клеток. Вы заметили, что я поместил готовые подложки mpad в три разные чашки для культивирования клеток. Клетки росли в течение ночи, и теперь я собираюсь обработать каждую чашку отдельным растворимым агентом, который известным образом модулирует сократимость.

Затем мы можем количественно измерить силы тяги, возникающие после фиксации клеток через 30 минут. После добавления растворимых факторов и спустя 30 минут после введения ингибиторов сократимости наступает время зафиксировать клетки параформальдегидом, чтобы зафиксировать текущее состояние сил тяги. Для этого важно использовать параформальдегид, содержащий кальций и магний; мы используем параформальдегид в объемной концентрации 3,7%. Метод погружения подложек в параформальдегид такой же, как и метод погружения подложек в различные RIN в процессе функционализации.

То есть важно не допускать высыхания субстратов, так как это может привести к коллапсу структур. После переноса субстратов я оставляю их инкубироваться в параформальдегиде на 20 минут. По истечении 20 минут мы извлекаем субстраты из параформальдегида; теперь, когда клетки зафиксированы, мы можем приступить к обработке этих образцов для стандартного иммуноокрашивания.

Для этого мы помещаем подложки лицевой стороной вверх на парафин и пипетируем достаточное количество PBS, чтобы покрыть подложку и сохранить её под слоем PBS. Затем мы трижды промываем подложку PBS, чтобы удалить остатки параформальдегида, который мог остаться в культуре. После трехкратной промывки подложки PBS её можно перенести для последующего иммуноокрашивания.

Для этого мы захватываем подложку пинцетом и переворачиваем её на первом этапе иммуноокрашивания, которым является обработка пермеабилизирующим агентом. В данном случае мы используем 0.2% Triton X в PBS. Тем не менее, пользователь может выбрать любой пермеабилизирующий агент, наиболее подходящий для его целей.

Мы повторяем эту процедуру для всех наших подложек; таким образом осуществляется работа с подложками в процессе иммуноокрашивания. После иммуноокрашивания подложки монтируются на стандартный предметный стеклянный слайд размером один на три дюйма, который затем можно исследовать на любом эпифлуоресцентном микроскопе, будь он перевернутым или прямым. Анализируя образцы на конфокальном микроскопе, мы можем сфокусироваться на основании столбиков, чтобы определить нулевые позиции без отклонения.

Затем мы можем сфокусироваться на кончиках столбиков, сделать еще один снимок и, сравнив верхнее и нижнее изображения, измерить отклонение столбиков и рассчитать силы тяги, которые создавали клетки для возникновения таких отклонений. Повторяя этот процесс для множества различных клеток при нескольких различных условиях, мы сможем сравнить силы тяги, возникающие в этих условиях. Теперь, когда мы собрали изображения как живых, так и фиксированных клеток, наша следующая задача — измерить отклонение и определить силы тяги в клетках.

Для этого мы написали компьютерную программу в matlab. Вот три изображения, которые мы будем использовать в данном анализе. Первое изображение представляет собой фазовое изображение клетки.

Это помогает определить местоположение клетки. Второе изображение представляет собой флуоресцентный снимок верхней части столбиков. Мы используем это изображение для определения положения кончиков столбиков.

Как видно, некоторые из этих столбиков отклонены и выходят за пределы прямоугольной решетки, в которой расположены большинство столбиков, например, этот столбик. И вот этот. Третьим изображением, которое мы будем использовать, станет базовое изображение, фиксирующее положение столбиков в фокальной плоскости, проходящей через их основание.

На этом этапе как отклоненные, так и неотклоненные стойки должны находиться в своем исходном, недеформированном положении. На прямоугольной решетке видно, что стойки, которые были отклонены у основания на втором изображении, теперь находятся в своем исходном положении. Это изображение используется для определения положения стойки в ее недеформированном состоянии.

Затем мы запускаем программу MATLAB, которая предложит загрузить эти три изображения. Присвойте файлу имя. Перед вами фазовое изображение.

Мы обведем рамкой область, в которой находится клетка, чтобы программа знала, какие столбики необходимо анализировать. Затем программа выполняет анализ интенсивности, пороговую обработку и сегментацию обрезанного изображения для определения координат OID столбиков. Слева представлены сегментированные изображения столбиков с верхнего изображения, а справа — сегментированные изображения тех же столбиков с нижнего изображения.

После получения координат столбиков и OID программа может определить векторы смещения между вершиной и основанием каждого столбика. Эти векторы смещения столбиков можно преобразовать в векторы силы, умножив их на коэффициент жесткости столбика. Анализ этих клеточных сил можно проводить несколькими способами, например, путем расчета средней силы на клетку или средней силы на столбик.

Одним из полезных результатов является график векторов (quiver plot), с помощью которого можно визуализировать пространственное распределение сил. Это та же клетка, которую мы только что анализировали; вы видите, что я наложил желтые стрелки на стойки, которые соответствуют величине силы и указывают направление ее действия. Повторяя этот процесс анализа изображений для последовательностей кадров, таких как те, что необходимы для нашего таймлапс-видео, мы можем создать временную последовательность.

Перед вами видеозапись клетки, которую мы стимулировали сывороткой. Как видно, сразу после добавления сыворотки сократимость клетки увеличилась, и она еще сильнее отклонила столбики. Кроме того, мы можем количественно оценить силы для большего числа клеток, подвергнутых различным условиям с последующей фиксацией и окрашиванием, что продемонстрировано на этих диаграммах векторов (quiver plots), где показана клетка, обработанная контрольным соединением, в сравнении с клетками, обработанными ингибиторами сократимости.

Как вы можете видеть, векторы силы, действующие на клетку в контрольном случае, больше по длине и величине, чем векторы силы в двух случаях, где использовались ингибиторы сократимости. Мы рассмотрели большой объем материала для описания метода подготовки субстрата — от микрофабрикации до подготовки образцов, проведения экспериментов и анализа, чтобы продемонстрировать универсальность данных субстратов.

Мы описали два различных метода анализа — визуализацию живых клеток и анализ фиксированных образцов, а также провели анализ клеток, полученных обоими этими методами, и продемонстрировали графики и видео с векторными полями (quiver plots). С помощью этого мощного инструмента можно проводить разнообразный пространственный и временной анализ сократимости клеток. Как вы видели, данный метод опирается на множество различных дисциплин, включая микрофабрикацию, фундаментальную клеточную биологию, науку о поверхностях, анализ и обработку изображений, а также многие другие.

И именно благодаря тому, что данный метод основан на нескольких различных инженерных подходах, такие параметры, как геометрия столбика, индуцированные растворимые факторы и способы анализа отклонения столбиков, могут быть адаптированы в зависимости от потребностей пользователя. Мы надеемся, что наглядная демонстрация этого метода, представленная за последние 20–30 минут, послужит отправной точкой для других, более глубоких исследований регуляции, функциональных последствий и механизмов возникновения сил клеточного притяжения.