Использование оптической ловушки для изучения хост-Возбудитель Взаимодействие для динамических изображений Живая сотовый

Общая цель следующего эксперимента заключается в использовании оптического захвата в сочетании с конфокальной микроскопией со вращающимся диском для наблюдения за взаимодействием хозяина и патогена в режиме реального времени. Для этого сначала в камеру на покровном стекле добавляют интересующие патогены. Затем выбирают частицу и захватывают ее с помощью оптической ловушки.

Наконец, частица направляется к интересующей клетке, как показано здесь. Оптический захват может быть эффективным методом управления двумя частицами для наблюдения за динамическими внутриклеточными взаимодействиями.

Данный метод позволяет ответить на важные вопросы о взаимодействии хозяина и патогена в области инфекционных заболеваний и иммунологии, включая влияние на фагоцитоз при достижении полного контроля над пространственными отношениями между клетками хозяина и патогенами, а также вопрос о том, влияет ли последовательность поглощения патогенов фагоцитирующей клеткой на созревание фагосомы. Как правило, специалисты, впервые использующие этот метод, сталкиваются с трудностями, поскольку условия захвата должны быть оптимизированы для различных типов клеток и микросфер. Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение, так как процесс настройки и интеграции вращающегося диска требует детального разъяснения.

Конфокальную систему с оптической ловушкой трудно представить из-за необходимости точной юстировки всех оптических компонентов. Соберите интересующий патоген. Например, в данном случае из культуры извлекают 300 µL Canada albicans, выращенного в бульоне в течение ночи, и переносят патогены в реакционную пробирку объемом 1.5 мл.

Затем промойте патогены трижды, центрифугируя при приблизительно 1300 Gs в течение пяти минут при комнатной температуре, каждый раз аспирируя супернатант и оставляя осадок нетронутым, затем ресуспендируйте в PBS и обработайте ультразвуком. После третьей промывки ресуспендируйте осадок в 500 µL PBS. Далее растворите 1 mg красителя entrust в 100 µL диметилформамида до конечной концентрации 10 mg/mL.

Затем добавьте 3 µL смеси красителя в пробирку с реакционной смесью, содержащую промытые патогены. Оберните пробирки фольгой, так как красители светочувствительны, и перемешивайте образец при 37 °C в течение одного часа, после чего осадите и промойте образец в PBS 3 раза, как и ранее. После последнего промывания ресуспендируйте осадок в 300 µL PBS.

Подогрейте среду с трипсином и PVS до 37 °C на водяной бане. Промойте 10-сантиметровую чашку для культивирования тканей с клетками макрофагов RAW 264.7 дважды с помощью PBS, аспирируя PBS после каждой промывки. Затем покройте поверхность чашки пятью миллилитрами трипсина и инкубируйте чашку в течение пяти минут при 37 °C.

Затем осторожно постучите по боковой поверхности планшета, чтобы отделить клетки от его поверхности, стараясь не допустить разбрызгивания трипсина за пределы планшета. Теперь добавьте в планшет 5 mL среды и перенесите смесь в реакционную пробирку.

После осаждения аспирируйте среду из пробирки с клетками, стараясь не повредить осадок, и ресуспендируйте его в 10 milliliters среды. Добавьте по 400 microliters среды в каждую камеру камерного предметного стекла, затем внесите по пять microliters клеточной суспензии в каждую камеру. Оставьте клетки для роста в инкубаторе при 37 degrees Celsius с 5%CO2 на ночь.

Извлеките камерную slide из инкубатора и пипетируйте от 5 до 10 µL ранее подготовленных флуоресцентно меченных исследуемых патогенов в каждую камеру с макрофагами. Тщательно перемешайте макрофаги и патогены путем многократного пипетирования, стараясь не касаться дна камеры, чтобы не потревожить прикрепившиеся макрофаги. Включите все компоненты конфокального микроскопа с вращающимся диском.

Подготовьте микроскоп, нанеся иммерсионное масло на объектив с масляным погружением. Поместите камерный предметный препарат на специализированный предметный столик, затем снимите верхнюю часть камеры и настройте микроскоп для визуализации методом дифференциального интерференционного контраста (DIC). Включите затвор оптической ловушки и ИК-лазер.

Затем откройте затвор лазера, идущего к оптической ловушке. С помощью ИК-карты убедитесь, что затвор перед ИК-лазером закрыт. Теперь сфокусируйтесь на макрофагах на предметном стекле с адгезированными клетками.

Затем найдите патогены, свободно плавающие в растворе рядом с макрофагами. Самой сложной частью данной процедуры является поиск подходящего объекта для отслеживания в кювете с образцом из-за сил адгезии между объектом и покровным стеклом кюветы. Чтобы переместить этот объект, необходимо двигать предметный столик, пока объект удерживается лазером ловушки; также важно отметить, что столик следует перемещать достаточно медленно, чтобы сила сопротивления не превышала максимальную удерживающую силу ловушки.

Переместите предметный столик так, чтобы патоген находился в непосредственной близости от ловушки. Затем откройте затвор и задействуйте ловушку. Переместите образец, чтобы макрофаги вступили в контакт с неподвижным захваченным изображением патогена.

Патогены с помощью конфокального микроскопа с вращающимся диском в режиме дифференциального интерференционного контраста (DIC), флуоресценции или их комбинации; отдельные популяции Candida albicans, размер которых обычно составляет около пяти микрон, были помечены зеленым, синим и красным цветами. Для демонстрации визуализации одиночная клетка C albicans была захвачена и перемещена по квадрату через скопление других дрожжей, как показано серыми стрелками, что демонстрирует возможность захвата и манипулирования конкретным расположением отдельного патогена, выбранного оператором, даже в плотной среде. Чтобы дополнительно проиллюстрировать гибкость этой системы в захвате различных морфологических форм, характерных для патогенных организмов, на данном рисунке оптический пинцет использовался для удержания и позиционирования частицы C albicans с псевдогифой.

Клетки C albicans помечены красным красителем и перемещаются по траектории, указанной белой стрелкой, после чего помещаются рядом с флуоресцентными клетками GFPL C3. На изображении выделены зеленым. Дрожжевая часть albicans была зафиксирована, в то время как псевдогифы тянулись следом.

Aspergillus fum также был расположен рядом с сырой клеткой макрофага мыши для анализа абсолютных временных рамок фагоцитоза с использованием данной конкретной клеточной линии и патогена. На этом рисунке изображения в светлом поле показывают, как захваченный aspergillus, отмеченный белой стрелкой, перемещался и позиционировался вдоль пути, указанного красной стрелкой. Захваченный патоген находится слегка вне фокуса, так как ловушка вытолкнула организм немного выше фокальной плоскости.

Грибок Aspergillus перемещали до тех пор, пока он не оказался рядом с выбранной исходной клеткой. Как только патоген вступил в контакт с клеткой, ловушку выключили. Процесс фагоцитоза был активирован, и для наблюдения за последующими клеточными событиями использовали таймлапс-съемку.

Через 30 секунд мембрана исходной клетки начала изменяться, образуя вокруг частицы углубление в форме чаши. Через 60 секунд чаша была полностью сформирована. В интервале от 90 до 150 секунд Afu Gotti охватывала частицу, и к 180 секундам частица была полностью интернализована.

После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как создать установку для оптической ловушки с вращающимся диском и как такой прибор позволяет неинвазивно управлять патогенами для визуализации живых клеток после его разработки. Этот метод открыл исследователям в области взаимодействий хозяина и патогена возможность изучать роль пространственных отношений между клетками хозяина и патогенами, а также их влияние на последующий иммунный ответ.